本发明涉及水稻病害防治相关，具体为一种芽孢杆菌mtc-8菌种制备方法及其应用。
背景技术：
1、水稻是世界上最重要的粮食作物，但水稻的高产、稳产、优质一直受到病虫害的制约。而稻瘟病是一种由子囊真菌稻瘟菌引起的世界性的水稻病害，是全世界稻区危害最严重的水稻病害之一。
2、由于稻瘟病的危害性与流行性，给水稻的产量带来了巨大的损失，因此有效防治水稻稻瘟病是提高水稻产量的关键。在当今社会主要依靠化学农药与抗性品种选育的方式来防治稻瘟病。近年来利用微生物来解决植物病害受到越来越多的关注
3、生物防治通常是指利用活体微生物或者其代谢活性物质防治病原菌、害虫和杂草以及调节植物生长的措施来预防或治疗植物的病害，其具有效果稳定明显、对环境的选择压力较小且不易使靶标病原菌产生抗药性等特点，是一种新型安全高效的植物病害防治方式，可以有效地解决水稻稻瘟病高抗品种和化学农药在生产上的局限性。
4、其中芽孢杆菌分布广泛、环境耐受力强、可产生多种代谢产物，且芽孢杆菌生防菌剂稳定性及相容性较强，是目前用于植物病害生物防治研究最多的一类生防细菌。芽孢杆菌以其耐热抗逆，环境友好等诸多优点成为近年生物防治研究的热点，目前已经报道的防治农作物病害的芽孢杆菌有很多，比如枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，但摩加夫芽孢杆菌在生物防治方面的报道还较少。
5、同时虽然生防芽孢杆菌抗病害的研究已经取得了较多成果，但生防产业化进程仍然任重道远。在产业化进程中，既要攻克生防菌发酵生产的培养基配方以及最适于繁殖的生长条件等产业化生产等关键技术。解决上述问题需要技术所有者和生产单位付出更多的时间和精力，才可能实现生防技术从研究成果向批量生产，乃至于实际应用的产业化进程。
6、鉴于此，针对上述问题，深入研究，遂有本案产生。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌mtc-8菌种制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出摩加夫芽孢杆菌在生物防治方面的应用上有不足，生防菌生产的培养基配方以及最适于繁殖的生长条件等产业化生产等关键技术仍有待突破的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种芽孢杆菌mtc-8菌种制备方法；
3、经过平板对峙实验筛选水稻内生菌及附生菌中的拮抗菌株，选取有抑制稻瘟病菌生长效果的拮抗菌株mtc-8进行菌液培养制备菌剂；
4、所述制备方法具体内容包括：
5、mtc-8菌液培养时间
6、通过mtc-8生长曲线测定和mtc-8芽孢率测定确定mtc-8菌液培养时间，确定选择生长稳定期48h~72h为菌液培养时间；
7、最适载体
8、通过设置平行对照组对比实验，使用相同质量的木质素纤维、膨润土、硅藻土、木质素磺酸钠、滑石粉、水、轻质碳酸钙、高岭土分别作为载体进行对比，确定选择木质素纤维作为mtc-8菌剂的载体；
9、c、最佳保护剂
10、通过设置平行对照组对比实验，使用淀粉、糊精、谷氨酸钠、蔗糖中的两种混合物作为抗热保护剂行对比，确定选择谷氨酸钠＋蔗糖作为mtc-8菌剂的保护剂；
11、d、菌剂最佳配比
12、使用上述最适载体和最佳抗热保护剂，按不同的载体、抗热保护剂、菌液比例制备菌剂进行平行对照组实验对比，确定选择木质素纤维：谷氨酸钠＋蔗糖：菌液为3：7：90为mtc-8菌剂的最佳配比。
13、优选的，所述平板对峙实验先在制作好的cm平板上接种稻瘟病菌菌块，恒温培养4d后，在平板四周距稻瘟菌菌块20mm处接种分离出的细菌，28℃恒温倒置培养，2d后观察并记录有抑菌活性的菌株，筛选拮抗菌株。
14、优选的，所述mtc-8生长曲线测定具体包括：按2%的接种量将mtc-8种子液加入到100ml灭菌后的玉米粉蛋白胨培养基中，于28℃、180r/min震荡培养，分别取0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h的菌液测其吸光度（od600），绘制生长曲线，以确定菌体数量最多的培养时间。
15、优选的，所述mtc-8芽孢率测定具体包括：按2%的接种量将mtc-8种子液加入到100ml灭菌后的玉米粉蛋白胨培养基中，于28℃、180r/min震荡培养48h、60h、72h，备用；取三张洁净的载玻片，选取合适位置分别滴加上述培养时间的菌液，用镊子夹住载玻片于酒精灯外焰烘烤片刻，使菌液干燥并将菌种固定；向载玻片滴加数滴5%孔雀绿染色液覆盖涂菌部位，于酒精灯加热至染液冒蒸汽但并不沸腾并维持10min，加热时注意补充染液，切勿让染液干涸；待其略冷却后，使用无菌水冲洗至无明显染液脱出为止；滴加番红染色液涂菌部位复染约2min，无菌水冲洗至至无明显染液脱出为止；待干燥后油镜观察，菌体呈红色，芽孢呈绿色；每个样品取3个视野计数，在油镜下计数芽孢个数及总体菌数，芽孢生成率=芽孢数/总菌数×100%。
16、优选的，所述最适载体的筛选具体包括：使用电子天平称取相同质量的载体，分别为木质素纤维、膨润土、硅藻土、木质素磺酸钠、滑石粉、水、轻质碳酸钙、高岭土，按相同比例（载体：菌液=1:9）与mtc-8菌液相混合；将混合体系放置于冷冻干燥仪中冷冻干燥过夜，将干燥后的样品粉碎，过80目筛后于60℃烘箱中再次烘干；将样品使用无菌水稀释后在na培养基上涂布平板，将菌液同样使用无菌水进行稀释后涂布平板，于28℃培养箱培养48h后统计菌落数量，每组设置三个平行。
17、优选的，所述最佳保护剂的筛选具体包括：使用电子天平称取相同质量的抗热保护剂，分别为淀粉＋糊精、淀粉＋谷氨酸钠、淀粉＋蔗糖、糊精＋谷氨酸钠、糊精＋蔗糖、谷氨酸钠＋蔗糖（上述组合中各抗热保护剂分别称取0.5g）、淀粉、糊精、谷氨酸钠、蔗糖，按相同比例（抗热保护剂：载体：菌液=1：9：90）与筛选出的最适载体和mtc-8菌液相混合；将混合体系放置于冷冻干燥仪中冷冻干燥过夜，将干燥后的样品粉碎，过80目筛后于60℃烘箱中再次烘干；将样品使用无菌水稀释后在na培养基上涂布平板，将菌液同样使用无菌水进行稀释后涂布平板，于28℃培养箱培养48h后统计菌落数量，每组设置三个平行。
18、优选的，所述菌剂最佳配比的选择具体包括：使用筛选出的最适载体和最佳抗热保护剂，选择不同的载体、抗热保护剂、菌液比例（1：9：90、2：8：90、3：7：90）制备菌剂，将混合体系放置于冷冻干燥仪中冷冻干燥过夜，将干燥后的样品粉碎，过80目筛后于60℃烘箱中再次烘干；将样品使用无菌水稀释后在na培养基上涂布平板，将菌液同样使用无菌水进行稀释后涂布平板，于28℃培养箱培养48h后统计菌落数量，每组设置三个平行。
19、一种芽孢杆菌mtc-8菌种的应用，所述应用包括将配制好的mtc-8菌剂均匀接种到秧苗上用于预防和治疗稻瘟病。
20、优选的，所述mtc-8菌剂将制备的微生物菌剂用无菌水稀释后使用涂布平板法对菌落数量进行统计，有效活菌数为3.90×1011cfu/g；
21、所述mtc-8菌剂外观呈米白色，带有明显的摩加夫芽孢杆菌mtc-8气味，菌剂为疏松粉末；
22、所述mtc-8菌剂中水分含量为3.8%；
23、所述mtc-8菌剂上清液的ph值为8.0；
24、所述mtc-8菌剂于阴凉处保存六个月放置前后菌落数量无明显差异。
25、与现有技术相比，本发明的有益效果是：该芽孢杆菌mtc-8菌种制备方法及其应用，对摩加夫芽孢杆菌mtc-8的进行菌种培养制备菌剂，得到对稻瘟菌具有抑菌作用的物质，有利于今后生物农药的开发应用。同时，成功制成有防治作用的生防菌剂，确定mtc-8菌液最佳培养时间、最适载体、最佳保护剂、菌剂最佳配比，为其应用打下基础，有助于在产业化进程中，优化生防菌生产的培养基配方以及最适于繁殖的生长条件等产业化生产等关键技术。便于基于生产工厂的实际生产条件制定合理和科学的生产工艺，推进产业化进程。
1.一种芽孢杆菌mtc-8菌种制备方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌mtc-8菌种制备方法，其特征在于：所述平板对峙实验先在制作好的cm平板上接种稻瘟病菌菌块，恒温培养4d后，在平板四周距稻瘟菌菌块20mm处接种分离出的细菌，28℃恒温倒置培养，2d后观察并记录有抑菌活性的菌株，筛选拮抗菌株。
3.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌mtc-8菌种制备方法，其特征在于：所述mtc-8生长曲线测定具体包括：按2%的接种量将mtc-8种子液加入到100ml灭菌后的玉米粉蛋白胨培养基中，于28℃、180r/min震荡培养，分别取0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h的菌液测其吸光度（od600），绘制生长曲线，以确定菌体数量最多的培养时间。
4.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌mtc-8菌种制备方法，其特征在于：所述mtc-8芽孢率测定具体包括：按2%的接种量将mtc-8种子液加入到100ml灭菌后的玉米粉蛋白胨培养基中，于28℃、180r/min震荡培养48h、60h、72h，备用；取三张洁净的载玻片，选取合适位置分别滴加上述培养时间的菌液，用镊子夹住载玻片于酒精灯外焰烘烤片刻，使菌液干燥并将菌种固定；向载玻片滴加数滴5%孔雀绿染色液覆盖涂菌部位，于酒精灯加热至染液冒蒸汽但并不沸腾并维持10min，加热时注意补充染液，切勿让染液干涸；待其略冷却后，使用无菌水冲洗至无明显染液脱出为止；滴加番红染色液涂菌部位复染约2min，无菌水冲洗至无明显染液脱出为止；待干燥后油镜观察，菌体呈红色，芽孢呈绿色；每个样品取3个视野计数，在油镜下计数芽孢个数及总体菌数，芽孢生成率=芽孢数/总菌数×100%。
5.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌mtc-8菌种制备方法，其特征在于：所述最适载体的筛选具体包括：使用电子天平称取相同质量的载体，分别为木质素纤维、膨润土、硅藻土、木质素磺酸钠、滑石粉、水、轻质碳酸钙、高岭土，按相同比例（载体：菌液=1:9）与mtc-8菌液相混合；将混合体系放置于冷冻干燥仪中冷冻干燥过夜，将干燥后的样品粉碎，过80目筛后于60℃烘箱中再次烘干；将样品使用无菌水稀释后在na培养基上涂布平板，将菌液同样使用无菌水进行稀释后涂布平板，于28℃培养箱培养48h后统计菌落数量，每组设置三个平行。
6.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌mtc-8菌种制备方法，其特征在于：所述最佳保护剂的筛选具体包括：使用电子天平称取相同质量的抗热保护剂，分别为淀粉＋糊精、淀粉＋谷氨酸钠、淀粉＋蔗糖、糊精＋谷氨酸钠、糊精＋蔗糖、谷氨酸钠＋蔗糖（各抗热保护剂分别称取0.5g）、淀粉、糊精、谷氨酸钠、蔗糖，按相同比例（抗热保护剂：载体：菌液=1：9：90）与筛选出的最适载体和mtc-8菌液相混合；将混合体系放置于冷冻干燥仪中冷冻干燥过夜，将干燥后的样品粉碎，过80目筛后于60℃烘箱中再次烘干；将样品使用无菌水稀释后在na培养基上涂布平板，将菌液同样使用无菌水进行稀释后涂布平板，于28℃培养箱培养48h后统计菌落数量，每组设置三个平行。
7.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌mtc-8菌种制备方法，其特征在于：所述菌剂最佳配比的选择具体包括：使用筛选出的最适载体和最佳抗热保护剂，选择不同的载体、抗热保护剂、菌液比例（1：9：90、2：8：90、3：7：90）制备菌剂，将混合体系放置于冷冻干燥仪中冷冻干燥过夜，将干燥后的样品粉碎，过80目筛后于60℃烘箱中再次烘干；将样品使用无菌水稀释后在na培养基上涂布平板，将菌液同样使用无菌水进行稀释后涂布平板，于28℃培养箱培养48h后统计菌落数量，每组设置三个平行。
8.一种芽孢杆菌mtc-8菌种的应用，其特征在于：所述应用包括将配制好的mtc-8菌剂均匀接种到秧苗上用于预防和治疗稻瘟病。
9.根据权利要求8所述的一种芽孢杆菌mtc-8菌种的应用，其特征在于：所述mtc-8菌剂将制备的微生物菌剂用无菌水稀释后使用涂布平板法对菌落数量进行统计，有效活菌数为3.90×1011cfu/g；
