本发明属于酶工程，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其应用。
背景技术：
1、碱性蛋白酶是指在ph值偏碱性范围内能够水解蛋白质肽键的一类酶，其作用范围广、水解能力强，是目前工业中用量较多的酶之一，是洗涤剂生产、食品工业、医药、饲料、化学工业、废物处理及皮革制造等行业中的重要酶制剂。微生物由于其具有更高的生产效率、对生长条件要求低和易于改造等优点，已经成为了工业碱性蛋白酶制剂的主要来源。
2、芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶因具有更强的酶活力与环境耐受性，已成为碱性蛋白酶最主要的来源。克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausii)作为芽孢杆菌中的一种，相比于其他芽孢杆菌，在环境耐受性上具有较为独特的性质。有研究表明，克劳氏芽孢杆菌在高酸、高盐环境下能够保持较高的活性。克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶作为克劳氏芽孢杆菌的分泌蛋白，也保有了其一定程度的环境耐受性，这使得克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶具有良好的应用潜力。但目前克劳氏芽孢杆菌来源碱性蛋白酶适用温度范围较小并且集中在中温环境，而在食品工业和饲料生产等行业中，一般需要在较高温和高盐的环境下使用酶类进行酶解反应，这使得克劳氏芽孢杆菌来源碱性蛋白酶无法应用于食品发酵、饲料生产等生产应用行业，从而极大的限制了其应用范围。
3、目前针对克劳氏芽孢杆菌来源碱性蛋白酶已有一些关于改造与应用的研究，如专利cn115851679a中，利用重叠pcr技术对克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶基因进行迭代饱和突变，筛选出低温下高活力的突变体，以满足在洗涤剂、丝绸等领域的应用需求。专利cn112458072a，通过易错pcr进行随机突变，通过高通量筛选后获得了十六个高活力碱性蛋白酶基因。但是目前仍未有报道在高温状态下仍有效发挥功能的克劳氏芽孢杆菌来源碱性蛋白酶突变体。克劳氏芽孢杆菌来源碱性蛋白酶作为一种可以在高盐环境保留活性的酶，本身具有一定的应用潜力，所以提高其热稳定性使其在高温环境下具有一定的活力具有重要的研究意义和应用潜力。
技术实现思路
1、基于以上技术问题，本发明的主要目的在于克服上述背景技术的不足之处，提供一种热稳定性高的克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausii)来源碱性蛋白酶突变体，其能够适应高温环境，在高温下仍保持有高活力，以满足食品、饲料、洗涤剂制备或制革等行业应用需求。
2、为实现上述目的，发明人进行了深入研究，并经重复多次研究论证而完成获得本发明方案，具体如下：
3、第一方面，本申请实施例提供了一种碱性蛋白酶突变体，所述碱性蛋白酶突变体由seq id no.1所示的氨基酸序列突变得到，突变位点包括s120i、g206p、s321c中的任一个或多个。
4、如本领域技术人员一般理解，所述的氨基酸取代的含义分别是第120位丝氨酸突变体为异亮氨酸、第206位甘氨酸突变为脯氨酸、第321位丝氨酸突变为半胱氨酸。
5、本发明的突变前序列seq id no.1为来自克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausii)的碱性蛋白酶apre。
6、具体地，突变后的碱性蛋白酶的氨基酸序列如seq id no.2-6任一所示。
7、第二方面，本申请实施例提供了一种基因，所述的基因编码上述碱性蛋白酶突变体。
8、第三方面，本申请实施例提供了一种重组表达载体，所述的重组表达载体携带有编码上述碱性蛋白酶突变体的基因。
9、所述的重组载体的载体骨架可以由本领域技术人员根据实施需要进行选择，可以是本领域已公开或未公开的任何具有表达能力的载体，包括但不限于真核载体和原核载体。优选为pbe载体，将本发明的蛋白酶基因插入到表达载体合适位点，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列连接。作为本发明的一个优选的实施方案，优选为将pbe载体原有的启动子和信号肽替换为p43和pamyq双启动子和mpr分泌信号肽。
10、第四方面，本申请实施例提供了一种重组宿主细胞，所述的重组宿主细胞为转化/转染有上述的重组表达载体的宿主细胞。
11、所述的宿主细胞的基础细胞可以是本领域已公开或未公开的任何具有表达能力的细胞类型，包括但不限于真核细胞或原核细胞；优选为芽孢杆菌，进一步优选为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。
12、第五方面，本申请实施例提供上述碱性蛋白酶突变体在蛋白质及肽链降解中的应用。
13、具体地，可用于酶解大豆蛋白。
14、第六方面，本申请实施例提供上述碱性蛋白酶突变体在食品、饲料、洗涤剂制备或制革中的应用。
15、耐高温碱性蛋白酶可应用于食品行业，耐高温碱性蛋白酶还可应用于奶酪的制作、肉类的软化、面包发酵以及生物活性肽的制备等，不仅可以改善食品的风味，还能够提高营养价值，降低食品的杂菌污染从而延长食品的保质期。在饲料行业的应用上，由蛋白酶水解各类蛋白产生的肽可用于家禽等的日粮中，能够改善动物的肠道健康、生长速度。在洗涤行业的应用上，加速对蛋白污渍如牛奶、血液、肉汁等的水解作用，从而节省洗涤时间和洗涤用水量，提高清洗效率，另一方面，加酶洗涤剂的使用改良了传统洗涤剂配方，减少了磷等对环境有害的化学物质以及漂白剂等的添加量，不仅可以保护人体免受洗涤剂的伤害，还可以增加环保效益。此外，在制革行业的应用上，耐高温碱性蛋白酶在脱毛时可有效地分解角蛋白和弹性蛋白，从而提升皮革质量；软化过程可以提高皮革的延展性和韧性，应用潜力巨大。
16、第七方面，本申请实施例提供一种酶制剂，所述酶制剂包含上述碱性蛋白酶突变体。
17、本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
18、1.本发明提供一种碱性蛋白酶突变体，改造后的克劳氏芽孢杆菌来源碱性蛋白酶热稳定性明显提高，经60℃高温处理1h后，突变体蛋白酶酶活保留率比原始蛋白酶高2-3倍，在60℃下的半衰期比原始蛋白酶高1.5-2.5倍。
19、2.本发明提供的碱性蛋白酶突变体，能在高温高盐环境保持较好的活性及酶解效率，在60℃处理5h后仍具有活性，在60℃的环境中，水解大豆蛋白产生氨基酸态氮的含量是原始蛋白酶的1.6-2倍，能够应用于食品、饲料、洗涤剂制备或制革。
1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体由seq id no.1所示的氨基酸序列突变得到，突变位点包括s120i、s321c、g206p中的任一个或多个。
2.如权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2-6任一所示。
3.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1或2所述的碱性蛋白酶突变体。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有权利要求3所述的基因。
5.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为转化/转染有权利要求4所述的重组表达载体的宿主细胞。
6.如权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌。
7.权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体在蛋白质及肽链降解中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为用于酶解大豆蛋白。
9.权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体在食品、饲料、洗涤剂制备或制革中的应用。
10.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含权利要求1或2所述的碱性蛋白酶突变体。
