本发明涉及生物医药工程，特别是涉及一种在蛋白质中引入α-羟基酸的方法。
背景技术：
1、与非天然氨基酸一样，α-羟基酸也无法被生物体本身的氨酰trna合成酶识别并引入。对于蛋白质，特别是多肽药物，α-羟基酸的修饰，不仅可能增强多肽药物的药效，降低药物毒性，还由于α-羟基酸的掺入，使得多肽药物大大降低免疫原性，减少免疫排异反应。并且还有望通过修饰，使多肽药物“搭载”其它化学附件，从而导致疾病治疗新方法的出现。对于多肽药物的修饰，大多只通过化学合成的方法修饰。
2、因此，本领域亟需开发一种在蛋白质中定点引入不同的α-羟基酸的方法。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种在蛋白质中引入α-羟基酸的方法，用于解决现有技术中无法在蛋白质中直接引入α-羟基酸的问题，同时，本发明还将提供一种质粒系统，用于将预定的α-羟基酸引入到目标蛋白中或制备含α-羟基酸的目标蛋白。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明的第一方面，提供一种在蛋白质中引入α-羟基酸的方法，包括以下步骤：
4、（1）构建重组质粒和目标蛋白质粒；
5、所述重组质粒含有编码突变型氨酰trna合成酶的基因；
6、所述目标蛋白质粒含有编码目标蛋白的基因，且目标蛋白质粒需引入α-羟基酸的位点被突变为终止密码子tag；
7、（2）将重组质粒和目标蛋白质粒共转化至宿主细胞，诱导培养所述宿主细胞，同时添加α-羟基酸。
8、本文所使用的术语“α-羟基酸”具有本领域公知的含义，指的是在α-碳上同时带有羟基和羧基的化合物，其结构如式(i)所示：
9、(i)；
10、其中，r可为任何基团，包括但不限于天然氨基酸的侧链。
11、在一优选例中，所述α-羟基酸包括2-羟基庚酸、s-烯丙基半胱羟基酸、s-叔丁基半胱羟基酸中的任一种。
12、在一优选例中，所述突变型氨酰trna合成酶对应于野生型马氏甲烷八叠球菌的氨酰trna合成酶(mmpylrs)发生突变，所述的突变如下：
13、n346m/c348w/y384f；
14、或n346m/c348w/y384f/v401a；
15、或n346m/c348w/y384f/v401k；
16、或n346m/c348w/y384f/w417h；
17、或n346m/c348w/y384f/v401a/w417h；
18、其中，所述野生型马氏甲烷八叠球菌的氨酰trna合成酶(mmpylrs)的氨基酸序列如seq id no.1所示。
19、在一优选例中，编码所述野生型mmpylrs的核苷酸序列seq id no.2所示。
20、在一优选例中，所述重组质粒为pevolve-mmrstrna。所述目标蛋白为任意需要引入α-羟基酸的蛋白。
21、在一优选例中，所述重组质粒/目标蛋白质粒还包含抗性基因、标签序列、阻遏蛋白基因（arac）、启动子基因（arabad）中的一种或几种。
22、其中，所述抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因(ampr)、氯霉素抗性基因(cmr)、卡那霉素抗性基因(kanar)、四环素抗性基因(tetr)中的一种或几种。
23、在一优选例中，所述宿主细胞包括大肠杆菌（e.coli）；优选为e.coli dh10b。
24、在一优选例中，所述大肠杆菌培养时，培养温度为37℃，诱导剂包括阿拉伯糖，α-羟基酸的浓度为1%。
25、在一优选例中，以egfp作为报告蛋白来检测α-羟基酸的引入效率。其中，所述egfp的第149位氨基酸碱基序列突变为终止密码子tag，构建报告蛋白质粒pbad-egfp(149tag)，所述报告蛋白质粒含有编码报告蛋白的基因。本发明以增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)作为报告蛋白来检测α-羟基酸的引入效率，可适用于所有α-羟基酸引入的检测。
26、本发明的第二方面，提供一种质粒系统，包括：
27、（1）第一表达盒，所述第一表达盒含有编码目标蛋白的第一编码序列，所述第一编码序列中含有用于引入预定的α-羟基酸的密码子，所述密码子为tag；和
28、（2）第二表达盒，所述第二表达盒含有编码突变型氨酰trna合成酶的第二编码序列；
29、所述质粒系统用于将预定的α-羟基酸引入到目标蛋白中或制备含α-羟基酸的目标蛋白。
30、如上所述，本发明的在蛋白质中引入α-羟基酸的方法，具有以下有益效果：本发明通过应用能够识别α-羟基酸的突变型氨酰trna合成酶，从而设计得到一种在蛋白质中有效引入α-羟基酸的方法；该方法以荧光蛋白egfp作为报告基因，构建质粒pbad-egfp(149tag)，该egfp的第149位氨基酸碱基序列突变为终止密码子tag，该egfp可用于检测α-羟基酸的引入效率，可适用于所有α-羟基酸引入的检测。
1.一种在蛋白质中引入α-羟基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的在蛋白质中引入α-羟基酸的方法，其特征在于，所述α-羟基酸为在α-碳上同时带有羟基和羧基的化合物，其结构如式(i)所示：
3.根据权利要求2所述的在蛋白质中引入α-羟基酸的方法，其特征在于，所述α-羟基酸包括2-羟基庚酸、s-烯丙基半胱羟基酸、s-叔丁基半胱羟基酸中的任一种。
4.根据权利要求1所述的在蛋白质中引入α-羟基酸的方法，其特征在于，所述突变型氨酰trna合成酶对应于野生型马氏甲烷八叠球菌的氨酰trna合成酶发生突变，所述的突变如下：
5.根据权利要求1所述的在蛋白质中引入α-羟基酸的方法，其特征在于，所述重组质粒为pevolve-mmrstrna；所述目标蛋白为任意需要引入α-羟基酸的蛋白。
6.根据权利要求1所述的在蛋白质中引入α-羟基酸的方法，其特征在于，所述重组质粒/目标蛋白质粒还包含抗性基因、标签序列、阻遏蛋白基因、启动子基因中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的在蛋白质中引入α-羟基酸的方法，其特征在于，所述抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的在蛋白质中引入α-羟基酸的方法，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌；所述大肠杆菌培养时，培养温度为37℃，诱导剂包括阿拉伯糖，α-羟基酸的浓度为1%。
9.根据权利要求1所述的在蛋白质中引入α-羟基酸的方法，其特征在于，以egfp作为报告蛋白，所述egfp的第149位氨基酸碱基序列突变为终止密码子tag，构建报告蛋白质粒pbad-egfp(149tag)，所述报告蛋白质粒含有编码所述报告蛋白的基因。
10.一种质粒系统，其特征在于，包括：
