背景技术：
1、常规基因疗法涉及使用dna来将所需遗传信息插入宿主细胞中。引入细胞中的dna通常在一定程度上整合至一个或多个转染细胞的基因组中，从而允许所引入的遗传物质在宿主中的长效作用。虽然这类持续作用可具有实质益处，但是外源性dna整合至宿主基因组中也可具有许多有害效应。举例来说，可能所引入的dna将插入完整基因中，导致阻碍或甚至完全消除内源性基因的功能的突变。因此，使用dna的基因疗法可导致损害所治疗宿主的重要遗传功能，如例如，消除或有害减少必需酶的产生或干扰对于细胞生长的调控起关键作用的基因，从而导致未经调控的或癌性的细胞增殖。另外，使用常规基于dna的基因疗法，为了有效表达所需基因产物，必需包括强启动子序列，这也可导致细胞中的正常基因表达的调控的不良变化。也可能基于dna的遗传物质将导致诱导不需要的抗dna抗体，其进而可触发可能致命的免疫应答。使用病毒载体的基因治疗方法也可导致不良免疫应答。在一些情况下，病毒载体甚至可整合至宿主基因组中。另外，临床级病毒载体的生产也昂贵并且费时。所引入的遗传物质使用病毒载体的靶向递送还可能难以控制。因此，虽然已经评估了基于dna的基因疗法使用病毒载体递送分泌的蛋白(美国专利号6,066,626；美国公布号us2004/0110709)，但这些方法可能因这些各种原因而受到限制。
2、与dna相比，使用rna作为基因治疗剂大致上更安全，因为rna不涉及稳定整合至转染细胞的基因组中的风险，由此消除了所引入的遗传物质将干扰必需基因的正常运作或导致引起有害或致癌效应的突变的顾虑，并且外来的启动子序列不为有效翻译所编码蛋白质所需要，再次避免了可能有害的副作用。此外，mrna不需要进入细胞核来执行其功能，而dna必须克服这一主要障碍。
3、环状rna可用于设计和产生稳定形式的rna。rna分子的环化为rna结构和功能的研究提供了优点，特别是在分子易于以无活性构象折叠的情况下(wang和ruffner，1998)。环状rna对体内应用也可特别令人感兴趣和有用，尤其是在基于rna的基因表达控制和治疗学的研究领域，包括蛋白质替代疗法和疫苗接种。
4、在本发明之前，存在用于体外制备环化rna的三种主要技术：夹板介导法、内含子-外显子置换法(permuted intron-exon method)和rna连接酶介导法。然而，现有方法受到可环化的rna的大小限制，从而限制了它们的治疗应用。本发明通过提供用于经由dna模板、前体线性rna和最终环状rna的序列的工程化来制造和优化环化rna的方法和组合物以及使用本发明的环状rna治疗有需要的受试者的方法解决了这种需要。
技术实现思路
1、本文描述了前体rna、环状rna，以及相关的组合物和方法。
2、在一个方面，本文提供了前体rna多核苷酸，其按以下顺序包含：a.5'增强型内含子元件，b.5'增强型外显子元件，c.核心功能元件，d.3'增强型外显子元件，和e.3'增强型内含子元件，其中所述核心功能元件按以下顺序包含：i.翻译起始元件(tie)，ii.编码元件，和iii.任选的终止密码子或终止盒。
3、在一个方面，本文提供了前体rna多核苷酸，其按以下顺序包含：a.5'增强型内含子元件，b.5'增强型外显子元件，c.核心功能元件，d.3'增强型外显子元件，和e.3'增强型内含子元件，其中所述核心功能元件按以下顺序包含：i.编码区，ii.任选的终止密码子或终止盒，和iii.翻译起始元件(tie)。
4、在一个方面，本文提供了前体rna多核苷酸，其按以下顺序包含：a.5'增强型内含子元件，b.5'增强型外显子元件，c.核心功能元件，d.3'增强型外显子元件，和e.3'增强型内含子元件，其中所述核心功能元件包含非编码元件。
5、在一些实施方案中，tie包含非翻译区(utr)或其片段、适体复合物或其片段或它们的组合。
6、在一些实施方案中，utr或其片段来源于病毒或真核信使rna。在一些实施方案中，utr或其片段包含病毒内部核糖体进入位点(ires)或真核ires。在一些实施方案中，核心功能元件包含两个或更多个ires。在一些实施方案中，核心功能元件包含tie、编码元件、终止序列、任选的间隔区、tie、编码元件和终止序列，其中tie包含ires。在一些实施方案中，ires包含选自seq id no:1-2983和3282-3287的序列或其片段。在一些实施方案中，ires包含选自seq id no:75、77、137、532、566、582、648、680、693、752、785、787、791、793、820、823、839、840、843、852、857、861、862、863、864、871、874、876、922、959、983、984、1015、1017、1023、1026、1031、1041、1047、1059、1068、1134、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1193、1198、1216、1218、1230、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1346、1354、1364、1367、1370、1432、1438、1440、2285、2465、2601、2615、2616、2617、2618、2627、2667、2681、2742、2746、2758、2777、2778、3282、3283、3286和3287的序列或其片段。在一些实施方案中，与野生型病毒ires或真核ires相比，ires包含一个或多个经修饰的核苷酸。
7、在一些实施方案中，ires能够促进由前体rna编码的蛋白质在细胞中的表达。在一些实施方案中，ires能够促进蛋白质的表达，使得蛋白质的表达水平与使用对照ires时相当或更高。在一些实施方案中，对照ires包含seq id no:3282的序列。在一些实施方案中，ires来源于肠道病毒、嵴病毒、副肠孤病毒或心病毒。在一些实施方案中，ires来源于肠道病毒或嵴病毒。
8、在一些实施方案中，细胞是肌管。在一些实施方案中，ires来源于bopivirus、梭状病毒、hunnivirus、passerivirus、mischivirus、嵴病毒、肠道病毒、心病毒、萨力病毒、rabovirus、副肠孤病毒、gallivirus或sicinivirus。在一些实施方案中，ires来源于hunnivirus、passerivirus、嵴病毒、bopivirus或肠道病毒。在一些实施方案中，ires来源于肠道病毒i、肠道病毒f、肠道病毒e、肠道病毒j、肠道病毒c、肠道病毒a、肠道病毒b、爱知病毒b、副肠孤病毒a、心病毒f、心病毒b或心病毒e。在一些实施方案中，ires包含选自seqid no:137、580、785、791、820、922、1041、1047、1068、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1354、1356、1432、1436、1439、1440、2285、2667、2746、2777、2778、3283和3284的序列。
9、在一些实施方案中，细胞是肝细胞。在一些实施方案中，ires来源于肠道病毒、bopivirus、mischivirus、gallivirus、梭状病毒、心病毒、嵴病毒、rabovirus、萨力病毒、副肠孤病毒、hunnivirus、鸟取病毒、passerivirus、寇沙病毒或sicinivirus。在一些实施方案中，ires来源于肠道病毒、mischivirus、嵴病毒、bopivirus或gallivirus。在一些实施方案中，ires来源于肠道病毒b、肠道病毒a、肠道病毒d、肠道病毒j、肠道病毒c、鼻病毒b、肠道病毒h、肠道病毒i、肠道病毒e、肠道病毒f、爱知病毒b、爱知病毒a、副肠孤病毒a、心病毒f、心病毒e或心病毒b。在一些实施方案中，ires包含选自seq id no:137、580、648、693、752、785、791、793、820、823、839、840、861、862、863、876、922、959、983、984、1015、1017、1023、1026、1031、1041、1047、1059、1068、1134、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1193、1198、1216、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1346、1354、1356、1432、1436、1438、1439、1440、2285、2777、2778、3283和3284的序列。
10、在一些实施方案中，细胞是t细胞。在一些实施方案中，ires来源于passerivirus、bopivirus、hunnivirus、mischivirus、肠道病毒、嵴病毒、rabovirus、鸟取病毒、萨力病毒、心病毒、副肠孤病毒、megrivirus、allexivirus、梭状病毒或shanbavirus。在一些实施方案中，ires来源于passerivirus、hunnivirus、mischivirus、肠道病毒或嵴病毒。在一些实施方案中，ires来源于肠道病毒i、肠道病毒d、肠道病毒c、肠道病毒a、肠道病毒j、肠道病毒h、爱知病毒b、副肠孤病毒a或心病毒b。在一些实施方案中，ires包含选自seq id no:77、787、793、820、839、840、843、852、857、861、862、863、864、871、874、876、959、1193、1216、1284、1287、1346、1356、1364、1432、1438、1440、2667、2681、2742、2746、2758、3283和3284的序列。
11、在一些实施方案中，适体复合物或其片段包含天然或合成适体序列。在一些实施方案中，适体复合物或其片段包含选自seq id no:3266-3268的序列。在一些实施方案中，适体复合物或其片段包含多于一种适体。
12、在一些实施方案中，tie包含utr和适体复合物。在一些实施方案中，utr位于适体复合物的上游。在一些实施方案中，tie还包括辅助元件。在一些实施方案中，辅助元件包含mirna结合位点或其片段、限制性位点或其片段、rna编辑基序或其片段、zip代码元件或其片段、rna运输元件或其片段或它们的组合。在一些实施方案中，辅助元件包含ires反式作用因子(itaf)的结合结构域。在一些实施方案中，结合结构域包含多聚a区、多聚c区、多聚ac区、多聚嘧啶串，或它们的组合或变体。在一些实施方案中，itaf包含多聚(rc)结合蛋白1(pcbp1)、pcbp2、pcbp3、pcbp4、多聚(a)结合蛋白1(pabp1)、多聚嘧啶串结合蛋白(ptb)、argonaute蛋白家族成员、hnrnpk(异质核内核糖核蛋白k蛋白)或la蛋白，或它们的片段或组合。
13、在一些实施方案中，编码元件包含编码治疗性蛋白质的序列。在一些实施方案中，治疗性蛋白质包含嵌合蛋白。在一些实施方案中，嵌合蛋白包含嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)、b细胞受体(bcr)、免疫细胞活化或抑制性受体、重组融合蛋白、嵌合突变型蛋白或融合蛋白或它们的组合。在一些实施方案中，治疗性蛋白质包含抗体、纳米抗体、非抗体蛋白、免疫调节配体、受体、结构蛋白、生长因子配体或受体、激素或激素受体、转录因子、检查点抑制剂或激动剂、fc融合蛋白、抗凝剂、凝血因子、伴侣蛋白、抗微生物蛋白、结构蛋白、生化酶、紧密连接蛋白、线粒体应激反应、细胞骨架蛋白、金属结合蛋白或小分子。在一些实施方案中，免疫调节配体包含干扰素、细胞因子、趋化因子或白细胞介素。在一些实施方案中，结构蛋白是通道蛋白或核孔蛋白。
14、在一些实施方案中，非编码元件包含多于一个非编码元件。在一些实施方案中，非编码元件包含50至15,000个核苷酸的长度。
15、在一些实施方案中，核心功能元件包含终止序列。在一些实施方案中，终止序列位于3'增强型外显子元件的5'端。在一些实施方案中，终止序列是终止密码子。在一些实施方案中，终止序列是终止盒。在一些实施方案中，终止盒在一个或多个框架中包含一个或多个终止密码子。在一些实施方案中，每个框架包含终止密码子。在一些实施方案中，每个框架包含两个或更多个终止密码子。
16、在一些实施方案中，5'增强型内含子元件包含3'内含子片段。在一些实施方案中，3'内含子片段还包含3’i组内含子剪接位点二核苷酸的第一个核苷酸或第一个和第二个核苷酸。在一些实施方案中，3'内含子片段位于5'增强型内含子元件的3’端。在一些实施方案中，i组内含子包含源自细菌噬菌体、病毒载体、细胞器基因组、核rdna基因。在一些实施方案中，核rdna基因包含源自真菌、植物或藻类的核rdna基因或其片段。
17、在一些实施方案中，5'增强型内含子元件包含位于5'端的前导非翻译序列。在一些实施方案中，前导非翻译序列包含间隔区。在一些实施方案中，前导非翻译序列包含转录起始位点的最后一个核苷酸。在一些实施方案中，前导非翻译序列包含1至100个另外的核苷酸。
18、在一些实施方案中，5'增强型内含子元件包含5'亲和序列。在一些实施方案中，5'亲和序列包含多聚a、多聚ac或多聚嘧啶序列。在一些实施方案中，5'亲和序列包含10至100个核苷酸。在一些实施方案中，5'增强型内含子元件包含5'外部间隔区序列。在一些实施方案中，5'外部间隔区序列位于5'亲和序列与3'内含子片段之间。在一些实施方案中，5'外部间隔区序列具有约6至60个核苷酸的长度。在一些实施方案中，5'外部间隔区序列包含选自seq id no:3094-3152的序列或由其组成。
19、在一些实施方案中，5'增强型内含子元件按以下顺序包含：a.前导非翻译序列；b.5'亲和序列；c.5'外部间隔区序列；和d.包含3’i组内含子剪接位点的第一个核苷酸的3'内含子片段；其中所述前导非翻译序列包含转录起始位点的最后一个核苷酸和1至100个核苷酸。
20、在一些实施方案中，5'增强型内含子元件按以下顺序包含：a.前导非翻译序列；b.5’外部间隔区序列；c.5'亲和序列；和d.包含3’i组剪接位点的第一个核苷酸的3'内含子片段；其中所述前导非翻译序列包含转录起始位点的最后一个核苷酸和1至100个核苷酸。
21、在一些实施方案中，5'增强型内含子元件按以下顺序包含：a.前导非翻译序列；b.5'亲和序列；c.5'外部间隔区序列；和d.包含3’i组内含子剪接位点的第一个和第二个核苷酸的3'内含子片段；其中所述前导非翻译序列包含转录起始位点的最后一个核苷酸和1至100个核苷酸；并且其中所述5'增强型外显子元件包含缺少3’i组剪接位点二核苷酸的第二个核苷酸的3'外显子片段。
22、在一些实施方案中，5'增强型内含子元件按以下顺序包含：a.前导非翻译序列；b.5'外部间隔区序列；c.5'亲和序列；和d.包含3’i组剪接位点的第一个和第二个核苷酸的3'内含子片段；其中所述前导非翻译序列包含转录起始位点的最后一个核苷酸和1至100个核苷酸；并且其中所述5'增强型外显子元件包含缺少3’i组剪接位点二核苷酸的第二个核苷酸的3'外显子片段。
23、在一些实施方案中，5'增强型外显子元件包含3'外显子片段。在一些实施方案中，3'外显子片段还包含3’i组内含子剪接位点二核苷酸的第二个核苷酸。在一些实施方案中，3'外显子片段包含源自天然外显子的1至100个天然核苷酸。在一些实施方案中，天然外显子源自含有i组内含子的基因或其片段。在一些实施方案中，天然外显子来源于鱼腥藻属细菌、t4噬菌体病毒、twort噬菌体、四膜虫或固氮弧菌属细菌。
24、在一些实施方案中，5'增强型外显子元件包含位于3'外显子片段下游的5'内部间隔区序列。在一些实施方案中，5'内部间隔区序列的长度是约6至60个核苷酸。在一些实施方案中，5'内部间隔区序列包含选自seq id no:3094-3152的序列或由其组成。
25、在一些实施方案中，5'增强型外显子元件按以下顺序包含：a.包含3'i组内含子剪接位点二核苷酸的第二个核苷酸的3'外显子片段；和b.5'内部间隔区序列，其中所述3'外显子片段包含源自天然外显子的1至100个天然核苷酸。
26、在一些实施方案中，5'增强型外显子元件按以下顺序包含：a.3'外显子片段；和b.5'内部间隔区序列，其中所述3'外显子片段包含源自天然外显子的1至100个天然核苷酸；并且其中所述5'增强型内含子元件包含3'内含子片段，所述3'内含子片段包含3’i组剪接位点二核苷酸的第一个和第二个核苷酸。
27、在一些实施方案中，3'增强型外显子元件包含5'外显子片段。在一些实施方案中，5'外显子片段包含5’i组内含子片段的第一个核苷酸。在一些实施方案中，5'外显子片段还包含源自天然外显子的1至100个核苷酸。在一些实施方案中，天然外显子源自含有i组内含子的基因或其片段。
28、在一些实施方案中，3'增强型外显子元件包含3’内部间隔区序列。在一些实施方案中，3’内部间隔区序列位于终止序列与5’外显子片段之间。在一些实施方案中，3'内部间隔区的长度是约6至60个核苷酸。在一些实施方案中，3'内部间隔区包含选自seq id no:3094-3152的序列或由其组成。
29、在一些实施方案中，3'增强型外显子元件按以下顺序包含：a.3'内部间隔区序列；和b.包含5'i组内含子剪接位点二核苷酸的第一个核苷酸的5'外显子片段，其中所述5'外显子片段包含源自天然外显子的1至100个核苷酸。
30、在一些实施方案中，3'增强型外显子元件按包含：a.3'内部间隔区序列；和b.5'外显子片段，其中所述5'外显子片段包含源自天然外显子的1至100个核苷酸；其中所述3'增强型内含子元件包含5'内含子片段，所述5'内含子片段包含5’i组内含子剪接位点二核苷酸的第一个和第二个核苷酸。
31、在一些实施方案中，3'增强型内含子元件包含5'内含子片段。在一些实施方案中，5'内含子片段包含5’i组内含子剪接位点二核苷酸的第二个核苷酸。
32、在一些实施方案中，3'增强型内含子元件包含位于5’内含子的3'端的尾随非翻译序列。在一些实施方案中，尾随非翻译序列包含3至12个核苷酸。
33、在一些实施方案中，3'增强型内含子片段包含3'外部间隔区序列。在一些实施方案中，3'外部间隔区序列位于5'内含子片段与尾随非翻译序列之间。在一些实施方案中，3'外部间隔区序列具有6至60个核苷酸的长度。在一些实施方案中，3'外部间隔区序列包含选自seq id no:3094-3152的序列或由其组成。
34、在一些实施方案中，3'增强型内含子元件包含3'亲和序列。在一些实施方案中，3'亲和序列位于3’外部间隔区序列与尾随非翻译序列之间。在一些实施方案中，3'亲和序列包含多聚a、多聚ac或多聚嘧啶序列。在一些实施方案中，亲和序列包含10至100个核苷酸。
35、在一些实施方案中，5'增强型内含子元件还包含5'外部双链体序列；其中3'增强型内含子元件还包含3'外部双链体序列。在一些实施方案中，5'外部双链体序列和3'外部双链体序列彼此完全或部分互补。在一些实施方案中，5'外部双链体序列包含完全合成或部分合成的核苷酸。在一些实施方案中，3'外部双链体序列包含完全合成或部分合成的核苷酸。在一些实施方案中，3'外部双链体序列是约6至约50个核苷酸。在一些实施方案中，5'外部双链体序列是约6至约50个核苷酸。
36、在一些实施方案中，5'增强型外显子元件还包含5'内部双链体序列；其中3'增强型外显子元件还包含3’内部双链体序列。在一些实施方案中，5’内部双链体序列和3’内部双链体序列彼此完全或部分互补。在一些实施方案中，5’内部双链体序列包含完全合成或部分合成的核苷酸。在一些实施方案中，3’内部双链体序列包含完全合成或部分合成的核苷酸。在一些实施方案中，3’内部双链体序列是约6至约19个核苷酸。在一些实施方案中，5’内部双链体序列是约6至约19个核苷酸。
37、在一些实施方案中，3'增强型内含子片段按以下顺序包含：a.包含5'i组内含子剪接位点二核苷酸的第二个核苷酸的5’内含子片段；b.3’外部间隔区序列；和c.3’亲和序列。
38、在一些实施方案中，3'增强型内含子片段按以下顺序包含：a.包含5'i组内含子剪接位点二核苷酸的第一个和第二个核苷酸的5’内含子片段；b.3’外部间隔区序列；和c.3’亲和序列，其中所述3'增强型外显子元件包含缺少5’i组内含子剪接位点二核苷酸的第一个核苷酸的5'外显子片段。
39、在一些实施方案中，所提供的前体rna多核苷酸按以下顺序包含：a.前导非翻译序列；b.5'亲和序列；c.5'外部双链体序列；d.5'间隔区序列；e.3'内含子片段；f.3'外显子片段；g.5'内部双链体序列；h.5'内部间隔区序列；i.翻译起始元件；j.编码元件；k.终止序列；l.3'内部间隔区序列；m.3'内部双链体序列；n.5'外显子片段；o.5'内含子片段；p.3'外部双链体序列；q.3'亲和序列；和r.尾随非翻译序列。
40、在一些实施方案中，所提供的前体rna多核苷酸按以下顺序包含：a.前导非翻译序列；b.5'亲和序列；c.5'外部间隔区序列；d.3'内含子片段；e.3'外显子片段；f.5'内部双链体序列；g.5'内部间隔区序列；h.非编码元件；i.3'内部间隔序列；j.3'内部双链体序列；k.5'外显子片段；l.5'内含子片段；m.3'外部间隔区序列；n.3'亲和序列；和o.尾随非翻译序列。
41、在一些实施方案中，所提供的前体rna多核苷酸按以下顺序包含：a.前导非翻译序列；b.5'亲和序列；c.5'外部间隔区序列；d.3'内含子片段；e.3'外显子片段；f.5'内部双链体序列；g.5'内部间隔区序列；h.翻译起始元件；i.编码元件；j.终止序列；k.3'内部间隔区序列；l.3'内部双链体序列；m.5'外显子片段；n.5'内含子片段；o.3’外部间隔区序列；和p.3’亲和序列。
42、在一些实施方案中，所提供的前体rna多核苷酸按以下顺序包含：a.前导非翻译序列；b.5'亲和序列；c.5'外部间隔区序列；d.3'内含子片段；e.3'外显子片段；f.5'内部间隔区序列；g.翻译起始元件；h.编码元件；i.终止序列；j.3'内部间隔区序列；k.5'外显子片段；l.5'内含子片段；m.3'外部间隔区序列；和n.3'亲和序列。
43、在一些实施方案中，所提供的前体rna多核苷酸按以下顺序包含：a.前导非翻译序列；b.5'亲和序列；c.5'外部间隔区序列；d.3'内含子片段；e.3'外显子片段；f.5'内部间隔区序列；g.非编码元件；h.3'内部间隔序列；i.5'外显子片段；j.5'内含子片段；k.3'外部间隔区序列；l.3'亲和序列；和m.尾随非翻译序列。
44、在一些实施方案中，所提供的前体rna多核苷酸按以下顺序包含：a.前导非翻译序列；b.5'亲和序列；c.5'外部双链体序列；d.5'间隔区序列；e.3'内含子片段；f.3'外显子片段；g.5'内部双链体序列；h.5'内部间隔区序列；i.终止序列；j.编码元件；k.翻译起始元件；l.3'内部间隔区序列；m.3'内部双链体序列；n.5'外显子片段；o.5'内含子片段；p.3'外部双链体序列；q.3'亲和序列；和r.尾随非翻译序列。
45、在一些实施方案中，编码元件包含两个或更多个蛋白质编码区。在一些实施方案中，前体rna多核苷酸包含编码第一与第二表达序列之间的蛋白水解裂解位点或核糖体停滞(stuttering)元件的多核苷酸序列。在一些实施方案中，核糖体停滞元件是自裂解间隔区。在一些实施方案中，前体rna多核苷酸包含编码2a核糖体停滞肽的多核苷酸序列。
46、在一些实施方案中，核心功能元件包含两个或更多个内部核糖体进入位点(ires)。在一些实施方案中，核心功能元件包含tie、编码元件、终止序列、任选的间隔区、tie、编码元件和终止序列，其中tie包含ires。
47、本文还提供了由本文提供的前体rna多核苷酸产生的环状rna多核苷酸。在一些实施方案中，前体rna多核苷酸从包含pcr产物、线性化质粒、非线性化质粒、线性化微环、非线性化微环、病毒载体、粘粒、cedna或人工染色体的载体或dna转录。在一些实施方案中，环状rna多核苷酸由天然核苷酸组成。在一些实施方案中，蛋白编码序列或非编码序列是密码子优化的。在一些实施方案中，环状rna多核苷酸的长度是约0.1至约15千碱基。在一些实施方案中，环状rna多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个微小rna结合位点。在一些实施方案中，环状rna多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个rna编辑敏感位点。在一些实施方案中，环状rna多核苷酸在人类中具有至少20小时的体内治疗效果持续时间。在一些实施方案中，环状rna多核苷酸具有至少6小时的功能性半衰期。在一些实施方案中，环状rna多核苷酸在人细胞中的治疗效果持续时间大于或等于包含相同表达序列的等效线性rna多核苷酸的治疗效果持续时间。在一些实施方案中，环状rna多核苷酸在人类中的体内治疗效果持续时间大于具有相同表达序列的等效线性rna多核苷酸的体内治疗效果持续时间。
48、本文还提供了一种制备翻译起始元件(tie)的方法，所述方法包括：a.获得病毒非翻译区(utr)；b.确定所述utr的能够结合至起始因子和/或通过渐进缺失序列来起始翻译的功能单元；c.去除所述utr的非功能单元；和任选地，修饰所述utr的末端。在一些实施方案中，utr末端的修饰是病毒utr的约1％至75％。在一些实施方案中，utr的功能单元通过从utr的5'和3'端进行缺失扫描或跨utr的长度进行突变扫描以鉴定重要区域来确定。
49、本文还提供了一种药物组合物，其包含本文提供的环状rna多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒、可生物降解纳米颗粒、可生物降解脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、聚合复合物或可生物降解聚合物纳米颗粒。在一些实施方案中，药物组合物包含靶向部分，其中在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导经受体介导的胞吞作用、内体融合或直接融合至选定细胞群或组织的选定细胞中。在一些实施方案中，药物组合物包含可操作地连接至所述纳米颗粒的靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分是小分子、scfv、纳米抗体、肽、环肽、二环肽或三环肽、微型抗体、多核苷酸适体、工程化支架蛋白、重链可变区、轻链可变区或其片段。在一些实施方案中，组合物中少于1重量％的多核苷酸是双链rna、dna夹板、dna模版或三磷酸化rna。在一些实施方案中，药物组合物中少于1重量％的多核苷酸和蛋白质是双链rna、dna夹板、dna模板、三磷酸化rna、磷酸酶蛋白质、蛋白质连接酶、rna聚合酶和加帽酶。
50、本文还提供了一种药物组合物，其包含本文提供的环状rna多核苷酸和脂质体、树状聚合物、碳水化合物载体、聚糖纳米材料、融合体、外泌体或其组合。
51、本文还提供了一种药物组合物，其包含本文提供的环状rna多核苷酸和药用盐、缓冲液、稀释剂或其组合。
52、本文还提供了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含本文提供的环状rna多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分是小分子、scfv、纳米抗体、肽、环肽、二环肽或三环肽、微型抗体、重链可变区、工程化支架蛋白、轻链可变区或其片段。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒或可生物降解纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、可电离脂质或聚β-氨基酯。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种非阳离子脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种peg修饰的脂质、聚谷氨酸脂质或透明质酸脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒包含胆固醇。在一些实施方案中，纳米颗粒包含花生四烯酸、白三烯或油酸。在一些实施方案中，组合物包含靶向部分，其中在没有细胞选择或纯化的情况下，所述靶向部分选择性地介导经受体介导的胞吞作用进入选定细胞群的细胞中。在一些实施方案中，纳米颗粒包含多于一种环状rna多核苷酸。在一些实施方案中，受试者患有选自由以下组成的组的癌症：急性骨髓性白血病(aml)；肺泡横纹肌肉瘤；b细胞恶性肿瘤；膀胱癌(例如，膀胱癌)；骨癌；脑癌(例如，成神经管细胞瘤和多形性成胶质细胞瘤)；乳腺癌；肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌；眼癌；肝内胆管癌；关节癌；颈癌；胆囊癌；胸膜癌；鼻癌、鼻腔癌或中耳癌；口腔癌；外阴癌；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性癌症；结肠癌；食道癌；宫颈癌；纤维肉瘤；胃肠类癌肿瘤；头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；肾癌；喉癌；白血病；液体肿瘤；脂肪瘤；肝癌；肺癌(例如，非小细胞肺癌、肺腺癌和小细胞肺癌)；淋巴瘤；间皮瘤；肥大细胞瘤；黑素瘤；多发性骨髓瘤；鼻咽癌；非霍奇金淋巴瘤；b-慢性淋巴细胞性白血病；毛细胞白血病；伯基特淋巴瘤；卵巢癌；胰腺癌；腹膜癌；网膜癌；肠系膜癌；咽癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；皮肤癌；小肠癌；软组织癌；实体瘤；滑膜肉瘤；胃癌；畸胎瘤；睾丸癌；甲状腺癌；和输尿管癌。在一些实施方案中，受试者患有选自以下的自身免疫性病症：硬皮病、格雷夫斯病、克罗恩氏病、薛格连氏综合征(sjorgen's disease)、多发性硬化症、桥本氏病(hashimoto'sdisease)、银屑病、重症肌无力、自身免疫性多内分泌病综合征、i型糖尿病(tidm)、自身免疫性胃炎、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、多发性肌炎、结肠炎、甲状腺炎和以人类狼疮为代表的广泛性自身免疫性疾病。
53、本文还提供了一种包含本文提供的环状rna多核苷酸或药物组合物的真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞是人细胞。在一些实施方案中，真核细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，真核细胞是t细胞、树突细胞、巨噬细胞、b细胞、嗜中性粒细胞或嗜碱性粒细胞。
54、本文还提供了一种包含本文提供的环状rna多核苷酸的原核细胞。
55、在另一个方面，本文提供了纯化环状rna的方法，所述方法包括使缀合至固体表面的寡核苷酸与亲和序列杂交。
56、在一些实施方案中，亲和序列的一个或多个拷贝存在于前体rna中。在一些实施方案中，前体rna是本文所述的前体。在一些实施方案中，环状rna是本文所述的环状rna。在一些实施方案中，亲和序列在环状rna的形成期间去除。在一些实施方案中，所述方法包括使环状rna与前体rna分离。
57、在一些实施方案中，亲和序列包含多聚a序列。在一些实施方案中，与亲和序列杂交的寡核苷酸是脱氧胸苷寡核苷酸。在一些实施方案中，亲和序列包含专用结合位点(dbs)。在一些实施方案中，dbs包含以下核苷酸序列：tataattctaccctattgaggcattgacta(seq id no:3269)。在一些实施方案中，与亲和序列杂交的寡核苷酸包含与dbs互补的序列。
58、在另一个方面，本文提供了纯化环状rna的方法，所述方法包括：a.使包含线性rna和环状rna的组合物与结合剂接触，所述结合剂相对于所述环状rna优先结合至所述线性rna；以及b.使结合至所述结合剂的rna与未结合至所述结合剂的rna分离。
59、在一些实施方案中，结合剂缀合至固体载体。在一些实施方案中，固体载体包含琼脂糖、琼脂糖衍生树脂、纤维素、纤维素纤维、磁珠、高通量微量滴定板、非琼脂糖树脂、玻璃表面、聚合物表面或其组合。在一些实施方案中，固体载体包含琼脂糖或纤维素。
60、在一些实施方案中，结合剂包含与存在于线性rna中而不存在于环状rna中的序列互补的寡核苷酸。在一些实施方案中，结合剂包含与存在于线性rna中而不存在于环状rna中的序列100％互补的寡核苷酸。在一些实施方案中，存在于线性rna中而不存在于环状rna中的序列是亲和序列。在一些实施方案中，存在于线性rna中而不存在于环状rna中的序列包含多聚a序列。在一些实施方案中，结合剂包含含有聚脱氧胸苷序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，存在于线性rna中而不存在于环状rna中的序列包含dbs序列。在一些实施方案中，dbs序列包含以下核苷酸序列：tataattctaccctattgaggcattgacta(seq id no:3269)。在一些实施方案中，存在于线性rna中而不存在于环状rna中的序列的长度是10-150个核苷酸。在一些实施方案中，存在于线性rna中而不存在于环状rna中的序列的长度是10-70个核苷酸。在一些实施方案中，存在于线性rna中而不存在于环状rna中的序列的长度是20-30个核苷酸。在一些实施方案中，存在于线性rna中而不存在于环状rna中的序列存在于线性rna中的两个位置。在一些实施方案中，存在于线性rna中而不存在于环状rna中的序列在线性rna的转录过程中被编码到线性rna中。在一些实施方案中，存在于线性rna中而不存在于环状rna中的序列被酶促添加至线性rna中。在一些实施方案中，线性rna不包含甲基鸟苷酸帽。在一些实施方案中，线性rna包含前体rna或其片段。
61、在一些实施方案中，前体rna是本文所述的前体rna或其片段。在一些实施方案中，使用体外转录(ivt)产生前体rna。在一些实施方案中，片段包含内含子。在一些实施方案中，线性rna包含过早终止rna或通过败育转录形成的rna。
62、在一些实施方案中，环状rna包含本文所述的环状rna。在一些实施方案中，使用包括剪接前体rna的方法产生环状rna。在一些实施方案中，存在于线性rna中而不存在于环状rna中的序列在剪接期间被切除。在一些实施方案中，环状rna的大小小于6千碱基。
63、在一些实施方案中，分离包括从固体载体去除未结合的rna。在一些实施方案中，去除包括从固体载体洗脱未结合的rna。
64、在一些实施方案中，方法包括加热组合物。在一些实施方案中，方法包括缓冲液交换。在一些实施方案中，在接触之前进行缓冲液交换。在一些实施方案中，在分离之后进行缓冲液交换。在一些实施方案中，在接触之前进行缓冲液交换，并且所得缓冲液包含大于1mm单价盐。在一些实施方案中，单价盐是nacl或kcl。在一些实施方案中，所得缓冲液包含tris。在一些实施方案中，所得缓冲液包含edta。在一些实施方案中，在分离至储存缓冲液中之后进行缓冲液交换，其中储存缓冲液包含1mm柠檬酸钠，ph 6.5。在一些实施方案中，方法包括在分离后过滤环状rna。
1.一种前体rna多核苷酸，其按以下顺序包含，
2.一种前体rna多核苷酸，其按以下顺序包含，
3.一种前体rna多核苷酸，其按以下顺序包含，
4.如权利要求1或2所述的前体rna多核苷酸，其中所述tie包含非翻译区(utr)或其片段、适体复合物或其片段或它们的组合。
5.如权利要求4所述的前体rna多核苷酸，其中所述utr或其片段来源于病毒或真核信使rna。
6.如权利要求5所述的前体rna多核苷酸，其中所述utr或其片段包含病毒内部核糖体进入位点(ires)或真核ires。
7.如权利要求1或2所述的前体rna多核苷酸，其中所述核心功能元件包含两个或更多个内部核糖体进入位点(ires)。
8.如权利要求7所述的前体rna多核苷酸，其中所述核心功能元件包含tie、编码元件、终止序列、任选的间隔区、tie、编码元件和终止序列，其中所述tie包含ires。
9.如权利要求6-8中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires包含选自seq idno：1-2983和3282-3287的序列或其片段。
10.如权利要求6-9中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires包含选自seq idno：75、77、137、532、566、582、648、680、693、752、785、787、791、793、820、823、839、840、843、852、857、861、862、863、864、871、874、876、922、959、983、984、1015、1017、1023、1026、1031、1041、1047、1059、1068、1134、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1193、1198、1216、1218、1230、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1346、1354、1364、1367、1370、1432、1438、1440、2285、2465、2601、2615、2616、2617、2618、2627、2667、2681、2742、2746、2758、2777、2778、3282、3283、3286和3287的序列或其片段。
11.如权利要求6-8中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中与野生型病毒ires或真核ires相比，所述ires包含一个或多个经修饰的核苷酸。
12.如权利要求6-11中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires能够促进由前体rna编码的蛋白质在细胞中的表达。
13.如权利要求12中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires能够促进所述蛋白质的表达，使得所述蛋白质的表达水平与使用对照ires时相当或更高。
14.如权利要求13所述的前体rna多核苷酸，其中所述对照ires包含seq id no：3282的序列。
15.如权利要求12-14中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires来源于肠道病毒、嵴病毒、副肠孤病毒或心病毒。
16.如权利要求12-15中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires来源于肠道病毒或嵴病毒。
17.如权利要求12-14中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述细胞是肌管。
18.如权利要求17所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires来源于bopivirus、梭状病毒、hunnivirus、passerivirus、mischivirus、嵴病毒、肠道病毒、心病毒、萨力病毒、rabovirus、副肠孤病毒、gallivirus或sicinivirus。
19.如权利要求17所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires来源于hunnivirus、passerivirus、嵴病毒、bopivirus或肠道病毒。
20.如权利要求17所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires来源于肠道病毒i、肠道病毒f、肠道病毒e、肠道病毒j、肠道病毒c、肠道病毒a、肠道病毒b、爱知病毒b、副肠孤病毒a、心病毒f、心病毒b或心病毒e。
21.如权利要求17所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires包含选自seq id no：137、580、785、791、820、922、1041、1047、1068、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1354、1356、1432、1436、1439、1440、2285、2667、2746、2777、2778、3283和3284的序列。
22.如权利要求12-14中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述细胞是肝细胞。
23.如权利要求22所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires来源于肠道病毒、bopivirus、mischivirus、gallivirus、梭状病毒、心病毒、嵴病毒、rabovirus、萨力病毒、副肠孤病毒、hunnivirus、鸟取病毒、passerivirus、寇沙病毒或sicinivirus。
24.如权利要求23所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires来源于肠道病毒、mischivirus、嵴病毒、bopivirus或gallivirus。
25.如权利要求23所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires来源于肠道病毒b、肠道病毒a、肠道病毒d、肠道病毒h、肠道病毒c、鼻病毒b、肠道病毒h、肠道病毒i、肠道病毒e、肠道病毒f、爱知病毒b、爱知病毒a、副肠孤病毒a、心病毒f、心病毒e或心病毒b。
26.如权利要求22所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires包含选自seq id no：137、580、648、693、752、785、791、793、820、823、839、840、861、862、863、876、922、959、983、984、1015、1017、1023、1026、1031、1041、1047、1059、1068、1134、1168、1169、1171、1177、1178、1179、1180、1189、1192、1193、1198、1216、1263、1276、1280、1282、1284、1287、1346、1354、1356、1432、1436、1438、1439、1440、2285、2777、2778、3283和3284的序列。
27.如权利要求12-14中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述细胞是t细胞。
28.如权利要求27所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires来源于passerivirus、bopivirus、hunnivirus、mischivirus、肠道病毒、嵴病毒、rabovirus、鸟取病毒、萨力病毒、心病毒、副肠孤病毒、megrivirus、allexivirus、梭状病毒或shanbavirus。
29.如权利要求28所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires来源于passerivirus、hunnivirus、mischivirus、肠道病毒或嵴病毒。
30.如权利要求28所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires来源于肠道病毒i、肠道病毒d、肠道病毒c、肠道病毒a、肠道病毒j、肠道病毒h、爱知病毒b、副肠孤病毒a或心病毒b。
31.如权利要求27所述的前体rna多核苷酸，其中所述ires包含选自seq id no：77、787、793、820、839、840、843、852、857、861、862、863、864、871、874、876、959、1193、1216、1284、1287、1346、1356、1364、1432、1438、1440、2667、2681、2742、2746、2758、3283和3284的序列。
32.如权利要求4所述的前体rna多核苷酸，其中所述适体复合物或其片段包含天然或合成适体序列。
33.如权利要求4所述的前体rna多核苷酸，其中所述适体复合物或其片段包含选自seqid no：3266-3268的序列。
34.如权利要求4所述的前体rna多核苷酸，其中所述适体复合物或其片段包含多于一种适体。
35.如权利要求1或2所述的前体rna多核苷酸，其中所述tie包含utr和适体复合物。
36.如权利要求35所述的前体rna多核苷酸，其中所述utr位于所述适体复合物的上游。
37.如权利要求1或2所述的前体rna多核苷酸，其中所述tie还包含辅助元件。
38.如权利要求37所述的前体rna多核苷酸，其中所述辅助元件包含mirna结合位点或其片段、限制性位点或其片段、rna编辑基序或其片段、zip代码元件或其片段、rna运输元件或其片段或它们的组合。
39.如权利要求37所述的前体rna多核苷酸，其中所述辅助元件包含ire s反式作用因子(itaf)的结合结构域。
40.如权利要求39所述的前体rna多核苷酸，其中所述结合结构域包含多聚a区、多聚c区、多聚ac区、多聚嘧啶串，或它们的组合或变体。
41.如权利要求39所述的前体rna多核苷酸，其中所述itaf包含多聚(rc)结合蛋白1(pcbp1)、pcbp2、pcbp3、pcbp4、多聚(a)结合蛋白1(pabp1)、多聚嘧啶串结合蛋白(ptb)、argonaute蛋白家族成员、hnrnpk(异质核内核糖核蛋白k蛋白)或la蛋白，或它们的片段或组合。
42.如权利要求1或2所述的前体rna多核苷酸，其中所述编码元件包含编码治疗性蛋白质的序列。
43.如权利要求42所述的前体rna多核苷酸，其中所述治疗性蛋白质包含嵌合蛋白。
44.如权利要求43所述的前体rna多核苷酸，其中所述嵌合蛋白包含嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)、b细胞受体(bcr)、免疫细胞活化或抑制性受体、重组融合蛋白、嵌合突变型蛋白或融合蛋白或它们的组合。
45.如权利要求42所述的前体rna多核苷酸，其中所述治疗性蛋白质包含抗体、纳米抗体、非抗体蛋白、免疫调节配体、受体、结构蛋白、生长因子配体或受体、激素或激素受体、转录因子、检查点抑制剂或激动剂、fc融合蛋白、抗凝剂、凝血因子、伴侣蛋白、抗微生物蛋白、结构蛋白、生化酶、紧密连接蛋白、线粒体应激反应、细胞骨架蛋白、金属结合蛋白或小分子。
46.如权利要求45所述的前体rna多核苷酸，其中所述免疫调节配体包含干扰素、细胞因子、趋化因子或白细胞介素。
47.如权利要求45所述的前体rna多核苷酸，其中所述结构蛋白是通道蛋白或核孔蛋白。
48.如权利要求3所述的前体rna多核苷酸，其中所述非编码元件包含多于一个非编码元件。
49.如权利要求3或48所述的前体rna多核苷酸，其中所述非编码元件包含50至15,000个核苷酸的长度。
50.如权利要求1或2中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述核心功能元件包含终止序列。
51.如权利要求50所述的前体rna多核苷酸，其中所述终止序列位于所述3′增强型外显子元件的5′端。
52.如权利要求50所述的前体rna多核苷酸，其中所述终止序列是终止密码子。
53.如权利要求50所述的前体rna多核苷酸，其中所述终止序列是终止盒。
54.如权利要求53所述的前体rna多核苷酸，其中所述终止盒在一个或多个框架中包含一个或多个终止密码子。
55.如权利要求54所述的前体rna多核苷酸，其中每个框包含终止密码子。
56.如权利要求54所述的前体rna多核苷酸，其中每个框包含两个或更多个终止密码子。
57.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′增强型内含子元件包含3′内含子片段。
58.如权利要求57所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′内含子片段还包含3’i组内含子剪接位点二核苷酸的第一个核苷酸或第一个核苷酸和第二个核苷酸。
59.如权利要求58所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′内含子片段位于所述5′增强型内含子元件的3’端。
60.如权利要求58所述的前体rna多核苷酸，其中所述i组内含子包含源自细菌噬菌体、病毒载体、细胞器基因组、核rdna基因。
61.如权利要求60所述的前体rna多核苷酸，其中所述核rdna基因包含源自真菌、植物或藻类的核rdna基因或其片段。
62.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′增强型内含子元件包含位于所述5′端的前导非翻译序列。
63.如权利要求62所述的前体rna多核苷酸，其中所述前导非翻译序列包含间隔区。
64.如权利要求62所述的前体rna多核苷酸，其中所述前导非翻译序列包含转录起始位点的最后一个核苷酸。
65.如权利要求64所述的前体rna多核苷酸，其中所述前导非翻译序列包含1至100个额外核苷酸。
66.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′增强型内含子元件包含5′亲和序列。
67.如权利要求66所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′亲和序列包含多聚a、多聚ac或多聚嘧啶序列。
68.如权利要求67所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′亲和序列包含10至100个核苷酸。
69.如权利要求1-3或57-68中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′增强型内含子元件包含5′外部间隔区序列。
70.如权利要求69所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′外部间隔区序列位于所述5′亲和序列与所述3′内含子片段之间。
71.如权利要求69所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′外部间隔区序列具有约6至60个核苷酸的长度。
72.如权利要求69所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′外部间隔区序列包含选自seqid no：3094-3152的序列或由其组成。
73.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5’增强型内含子元件按以下顺序包含：
74.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5’增强型内含子元件按以下顺序包含
75.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5’增强型内含子元件按以下顺序包含：
76.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5’增强型内含子元件按以下顺序包含：
77.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′增强型外显子元件包含3’外显子片段。
78.如权利要求78所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′外显子片段还包含3’i组内含子剪接位点二核苷酸的第二个核苷酸。
79.如权利要求78所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′外显子片段包含源自天然外显子的1至100个天然核苷酸。
80.如权利要求79所述的前体rna多核苷酸，其中所述天然外显子源自含有i组内含子的基因或其片段。
81.如权利要求79所述的前体rna多核苷酸，其中所述天然外显子来源于鱼腥藻属细菌、t4噬菌体病毒、twort噬菌体、四膜虫或固氮弧菌属细菌。
82.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′增强型外显子元件包含位于所述3′外显子片段下游的5′内部间隔区序列。
83.如权利要求82所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′内部间隔区序列的长度是约6至60个核苷酸。
84.如权利要求83所述的前体rna多核苷酸，其中所述5’内部间隔区序列包含选自seqid no：3094-3152的序列或由其组成。
85.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5’增强型外显子元件按以下顺序包含：
86.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5’增强型外显子元件按以下顺序包含：
87.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′增强型外显子元件包含5’外显子片段。
88.如权利要求87所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′外显子片段包含5’i组内含子片段的第一个核苷酸。
89.如权利要求87所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′外显子片段还包含源自天然外显子的1至100个核苷酸。
90.如权利要求87所述的前体rna多核苷酸，其中所述天然外显子源自含有i组内含子的基因或其片段。
91.如权利要求1-3或87中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′增强型外显子元件包含3’内部间隔区序列。
92.如权利要求91所述的前体rna多核苷酸，其中所述3’内部间隔区序列位于所述终止序列与所述5’外显子片段之间。
93.如权利要求91所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′内部间隔区的长度是约6至60个核苷酸。
94.如权利要求91中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述3’内部间隔区包含选自seq id no：3094-3152的序列或由其组成。
95.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′增强型外显子元件包含：
96.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′增强型外显子元件包含：
97.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′增强型内含子元件包含5′内含子片段。
98.如权利要求97所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′内含子片段包含5’i组内含子剪接位点二核苷酸的第二个核苷酸。
99.如权利要求1-3或96-98中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′增强型内含子元件包含位于所述5’内含子的3′端的尾随非翻译序列。
100.如权利要求99所述的前体rna多核苷酸，其中所述尾随非翻译序列包含3至12个核苷酸。
101.如权利要求1-3或96-100中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′增强型内含子片段包含3′外部间隔区序列。
102.如权利要求101所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′外部间隔区序列位于所述5’内含子片段与尾随非翻译序列之间。
103.如权利要求101所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′外部间隔区序列具有约6至60个核苷酸的长度。
104.如权利要求101中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′外部间隔区序列包含选自seq id no：3094-3152的序列或由其组成。
105.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′增强型内含子元件包含3′亲和序列。
106.如权利要求105所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′亲和序列位于所述3’外部间隔区序列与所述尾随非翻译序列之间。
107.如权利要求105所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′亲和序列包含多聚a、多聚ac或多聚嘧啶序列。
108.如权利要求105所述的前体rna多核苷酸，其中所述亲和序列包含10至100个核苷酸。
109.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′增强型内含子元件还包含5′外部双链体序列；其中3′增强型内含子元件还包含3′外部双链体序列。
110.如权利要求109所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′外部双链体序列和所述3′外部双链体序列彼此完全或部分互补。
111.如权利要求109所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′外部双链体序列包含完全合成或部分合成的核苷酸。
112.如权利要求109所述的前体rna多核苷酸，其中所述3′外部双链体序列包含完全合成或部分合成的核苷酸。
113.如权利要求109所述的前体rna多核苷酸，其中所述3’外部双链体序列是约6至约50个核苷酸。
114.如权利要求109所述的前体rna多核苷酸，其中所述5’外部双链体序列是约6至约50个核苷酸。
115.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述5′增强型外显子元件还包含5’内部双链体序列；其中所述3′增强型外显子元件还包含3’内部双链体序列。
116.如权利要求115所述的前体rna多核苷酸，其中所述5’内部双链体序列和所述3’内部双链体序列彼此完全或部分互补。
117.如权利要求115所述的前体rna多核苷酸，其中所述5’内部双链体序列包含完全合成或部分合成的核苷酸。
118.如权利要求115所述的前体rna多核苷酸，其中所述3’内部双链体序列包含完全合成或部分合成的核苷酸。
119.如权利要求115所述的前体rna多核苷酸，其中所述3’内部双链体序列是约6至约19个核苷酸。
120.如权利要求115所述的前体rna多核苷酸，其中所述5’内部双链体序列是约6至约19个核苷酸。
121.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述3’增强型内含子片段按以下顺序包含：
122.如权利要求1-3中任一项所述的前体rna多核苷酸，其中所述3’增强型内含子片段按以下顺序包含：
123.如权利要求1或2所述的前体rna多核苷酸，其按以下顺序包含：
124.如权利要求3所述的前体rna多核苷酸，其按以下顺序包含：
125.如权利要求1或2所述的前体rna多核苷酸，其按以下顺序包含：
126.如权利要求1或2所述的前体rna多核苷酸，其按以下顺序包含：
127.如权利要求3所述的前体rna多核苷酸，其按以下顺序包含：
128.如权利要求3所述的前体rna多核苷酸，其按以下顺序包含：
129.如权利要求1或2所述的前体rna多核苷酸，其中所述编码元件包含两个或更多个蛋白质编码区。
130.如权利要求129所述的前体rna多核苷酸，其包含编码所述第一表达序列与所述第二表达序列之间的蛋白水解裂解位点或核糖体停滞元件的多核苷酸序列。
131.如权利要求130所述的前体rna多核苷酸，其中所述核糖体停滞元件是自裂解间隔区。
132.如权利要求所述129的前体rna多核苷酸，其包含编码2a核糖体停滞肽的多核苷酸序列。
133.一种环状rna多核苷酸，其由如权利要求1-8中任一项所述的前体rna多核苷酸产生。
134.如权利要求133所述的环状rna多核苷酸，其由天然核苷酸组成。
135.如权利要求134中任一项所述的环状rna多核苷酸，其中所述蛋白质编码或非编码序列是密码子优化的。
136.如权利要求133-135中任一项所述的环状rna多核苷酸，其中所述环状rna多核苷酸的长度是约0.1至约15千碱基。
137.如权利要求133-136中任一项所述的环状rna多核苷酸，其被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个微小rna结合位点。
138.如权利要求133-137中任一项所述的环状rna多核苷酸，所述rna多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个rna编辑敏感位点。
139.如权利要求133-138中任一项所述的环状rna多核苷酸，其在人类中具有至少20小时的体内治疗效果持续时间。
140.如权利要求133-139中任一项所述的环状rna多核苷酸，其具有至少6小时的功能性半衰期。
141.如权利要求133-140所述的环状rna多核苷酸，其在人细胞中的治疗效果持续时间大于或等于包含相同表达序列的等效线性rna多核苷酸的治疗效果持续时间。
142.如权利要求133-141所述的环状rna多核苷酸，其在人类中的体内治疗效果持续时间大于具有相同表达序列的等效线性rna多核苷酸的体内治疗效果持续时间。
143.如权利要求133-142所述的环状rna多核苷酸，其中所述前体rna多核苷酸从包含pcr产物、线性化质粒、非线性化质粒、线性化微环、非线性化微环、病毒载体、粘粒、cedna或人工染色体的载体或dna转录。
144.一种制备翻译起始元件(tie)的方法，所述方法包括：
145.如权利要求144所述的方法，其中所述utr末端的修饰是所述病毒utr的约1％至75％。
146.如权利要求144或145所述的方法，其中utr的所述功能单元通过从所述utr的5’端和3′端进行缺失扫描或跨所述utr的长度进行突变扫描以鉴定重要区域来确定。
147.一种药物组合物，其包含如权利要求133-143中任一项所述的环状rna多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。
148.如权利要求147所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒、可生物降解纳米颗粒、可生物降解脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、聚合复合物或可生物降解聚合物纳米颗粒。
149.如权利要求147或148所述的药物组合物，其包含靶向部分，其中在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导经受体介导的胞吞作用、内体融合或直接融合至选定细胞群或组织的选定细胞中。
150.如权利要求147-149中任一项所述的药物组合物，其包含可操作地连接至所述纳米颗粒的靶向部分。
151.如权利要求147-150中任一项所述的药物组合物，其中所述靶向部分是小分子、scfv、纳米抗体、肽、环肽、二环肽或三环肽、微型抗体、多核苷酸适体、工程化支架蛋白、重链可变区、轻链可变区或其片段。
152.如权利要求147-151中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物中少于1重量％的多核苷酸是双链rna、dna夹板、dna模板或三磷酸化rna。
153.如权利要求147-152中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物中少于1重量％的所述多核苷酸和蛋白质是双链rna、dna夹板、dna模板、三磷酸化rna、磷酸酶蛋白质、蛋白质连接酶、rna聚合酶和加帽酶。
154.一种药物组合物，其包含如权利要求133-143中任一项所述的环状rna多核苷酸和脂质体、树状聚合物、碳水化合物载体、聚糖纳米材料、融合体、外泌体或它们的组合。
155.一种药物组合物，其包含如权利要求133-143中任一项所述的环状rna多核苷酸和药用盐、缓冲剂、稀释剂或它们的组合。
156.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含如权利要求147-155中任一项所述的环状rna多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。
157.如权利要求156所述的方法，其中所述靶向部分是小分子、scfv、纳米抗体、肽、环肽、二环肽或三环肽、微型抗体、重链可变区、工程化支架蛋白、轻链可变区或其片段。
158.如权利要求156-157中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒或可生物降解纳米颗粒。
159.如权利要求156-158中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、可电离脂质或聚β-氨基酯。
160.如权利要求156-159中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含一种或多种非阳离子脂质。
161.如权利要求156-160中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含一种或多种peg修饰的脂质、聚谷氨酸脂质或透明质酸脂质。
162.如权利要求156-161中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含胆固醇。
163.如权利要求156-162中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含花生四烯酸、白三烯或油酸。
164.如权利要求156-163中任一项所述的方法，其中所述组合物包含靶向部分，其中在没有细胞选择或纯化的情况下，所述靶向部分选择性地介导经受体介导的胞吞作用进入选定细胞群的细胞中。
165.如权利要求156-164中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含多于一种环状rna多核苷酸。
166.如权利要求156-165中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自由以下组成的组的癌症：急性骨髓性白血病(aml)；肺泡横纹肌肉瘤；b细胞恶性肿瘤；膀胱癌(例如，膀胱癌)；骨癌；脑癌(例如，成神经管细胞瘤和多形性成胶质细胞瘤)；乳腺癌；肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌；眼癌；肝内胆管癌；关节癌；颈癌；胆囊癌；胸膜癌；鼻癌、鼻腔癌或中耳癌；口腔癌；外阴癌；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性癌症；结肠癌；食道癌；宫颈癌；纤维肉瘤；胃肠类癌肿瘤；头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；肾癌；喉癌；白血病；液体肿瘤；脂肪瘤；肝癌；肺癌(例如，非小细胞肺癌、肺腺癌和小细胞肺癌)；淋巴瘤；间皮瘤；肥大细胞瘤；黑素瘤；多发性骨髓瘤；鼻咽癌；非霍奇金淋巴瘤；b-慢性淋巴细胞性白血病；毛细胞白血病；伯基特淋巴瘤；卵巢癌；胰腺癌；腹膜癌；网膜癌；肠系膜癌；咽癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；皮肤癌；小肠癌；软组织癌；实体瘤；滑膜肉瘤；胃癌；畸胎瘤；睾丸癌；甲状腺癌；和输尿管癌。
167.如权利要求156-166中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的自身免疫性病症：硬皮病、格雷夫斯病、克罗恩氏病、薛格连氏综合征、多发性硬化症、桥本氏病、银屑病、重症肌无力、自身免疫性多内分泌病综合征、i型糖尿病(tidm)、自身免疫性胃炎、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、多发性肌炎、结肠炎、甲状腺炎和以人类狼疮为代表的广泛性自身免疫性疾病。
168.一种真核细胞，其包含根据权利要求133-143中任一项所述的环状rna多核苷酸或如权利要求147-155中任一项所述的药物组合物。
169.如权利要求168所述的真核细胞，其中所述真核细胞是人细胞。
170.如权利要求169所述的真核细胞，其中所述真核细胞是免疫细胞。
171.如权利要求170所述的真核细胞，其中所述真核细胞是t细胞、树突细胞、巨噬细胞、b细胞、嗜中性粒细胞或嗜碱性粒细胞。
172.一种原核细胞，其包含根据权利要求133-143中任一项所述的环状rna多核苷酸。
173.一种纯化环状rna的方法，所述方法包括使缀合至固体表面的寡核苷酸与亲和序列杂交。
174.如权利要求173所述的方法，其中所述亲和序列的一个或多个拷贝存在于前体rna中。
175.如权利要求174所述的方法，其中所述前体rna是如权利要求44-54、83-86或103-110中任一项所述的前体rna。
176.如权利要求173-175中任一项所述的方法，其中所述环状rna是如权利要求117-127中任一项所述的环状rna。
177.如权利要求173-176中任一项所述的方法，其中所述亲和序列在所述环状rna的形成期间被除去。
178.如权利要求173-177中任一项所述的方法，其包括使所述环状rna与所述前体rna分离。
179.如权利要求173-178中任一项所述的方法，其中所述亲和序列包含多聚a序列。
180.如权利要求179所述的方法，其中与所述亲和序列杂交的所述寡核苷酸是脱氧胸苷寡核苷酸。
181.如权利要求173-178中任一项所述的方法，其中所述亲和序列包含专用结合位点(dbs)。
182.如权利要求181所述的方法，其中所述dbs包含以下核苷酸序列：tataattctaccctattgaggcattgacta(seq id no：3269)。
183.如权利要求181或182所述的方法，其中与所述亲和序列杂交的所述寡核苷酸包含与所述db s互补的序列。
184.一种纯化环状rna的方法，其包括：
185.如权利要求184所述的方法，其中所述结合剂缀合至固体载体。
186.如权利要求185所述的方法，其中所述固体载体包含琼脂糖、琼脂糖衍生树脂、纤维素、纤维素纤维、磁珠、高通量微量滴定板、非琼脂糖树脂、玻璃表面、聚合物表面或其组合。
187.如权利要求185或186所述的方法，其中所述固体载体包含琼脂糖或纤维素。
188.如权利要求184-187中任一项所述的方法，其中所述结合剂包含与存在于所述线性rna中而不存在于所述环状rna中的序列互补的寡核苷酸。
189.如权利要求184-188中任一项所述的方法，其中所述结合剂包含与存在于所述线性rna中而不存在于所述环状rna中的序列100％互补的寡核苷酸。
190.如权利要求188或189所述的方法，其中存在于所述线性rna中而不存在于所述环状rna中的所述序列是亲和序列。
191.如权利要求188-190中任一项所述的方法，其中存在于所述线性rna中而不存在于所述环状rna中的所述序列包含多聚a序列。
192.如权利要求184-191中任一项所述的方法，其中所述结合剂包含含有聚脱氧胸苷序列的寡核苷酸。
193.如权利要求188-192中任一项所述的方法，其中存在于所述线性rna中而不存在于所述环状rna中的所述序列包含dbs序列。
194.如权利要求193所述的方法，其中所述dbs序列包含以下核苷酸序列：tataattctaccctattgaggcattgacta(seq id no：3269)。
195.如权利要求188-194中任一项所述的方法，其中存在于所述线性rna中而不存在于所述环状rna中的所述序列的长度是10-150个核苷酸。
196.如权利要求188-194中任一项所述的方法，其中存在于所述线性rna中而不存在于所述环状rna中的所述序列的长度是10-70个核苷酸。
197.如权利要求188-194中任一项所述的方法，其中存在于所述线性rna中而不存在于所述环状rna中的所述序列的长度是20-30个核苷酸。
198.如权利要求188-197中任一项所述的方法，其中存在于所述线性rna中而不存在于所述环状rna中的所述序列存在于所述线性rna中的两个位置。
199.如权利要求188-198中任一项所述的方法，其中存在于所述线性rna中而不存在于所述环状rna中的所述序列在所述线性rna的转录过程中被编码到所述线性rna中。
200.如权利要求188-198中任一项所述的方法，其中存在于所述线性rna中而不存在于所述环状rna中的所述序列被酶促添加至所述线性rna中。
201.如权利要求184-200中任一项所述的方法，其中所述线性rna不包含甲基鸟苷酸帽。
202.如权利要求184-201中任一项所述的方法，其中所述线性rna包含前体rna或其片段。
203.如权利要求202所述的方法，其中所述前体rna是如权利要求44-54、83-86或103-110中任一项所述的前体rna或其片段。
204.如权利要求202或203所述的方法，其中使用体外转录(ivt)产生所述前体rna。
205.如权利要求202或203所述的方法，其中所述片段包含内含子。
206.如权利要求204或205所述的方法，其中所述线性rna包含过早终止rna或通过败育转录形成的rna。
207.如权利要求184-206中任一项所述的方法，其中所述环状rna包含如权利要求117-127中任一项所述的环状rna。
208.如权利要求184-207中任一项所述的方法，其中使用包括剪接所述前体rna的方法产生所述环状rna。
209.如权利要求208所述的方法，其中存在于所述线性rna中而不存在于所述环状rna中的所述序列在所述剪接期间被切除。
210.如权利要求184-209中任一项所述的方法，其中所述环状rna的大小小于6千碱基。
211.如权利要求184-210中任一项所述的方法，其中所述分离包括从所述固体载体去除所述未结合的rna。
212.如权利要求211所述的方法，其中所述去除包括从所述固体载体洗脱所述未结合的rna。
213.如权利要求184-212中任一项所述的方法，其包括加热所述组合物。
214.如权利要求184-213中任一项所述的方法，其包括缓冲液交换。
215.如权利要求214所述的方法，其中在所述接触之前进行缓冲液交换。
216.如权利要求214或215所述的方法，其中在所述分离之后进行缓冲液交换。
217.如权利要求214-216中任一项所述的方法，其中在所述接触之前进行缓冲液交换，并且所得缓冲液包含大于1mm单价盐。
218.如权利要求217所述的方法，其中所述单价盐是nacl或kcl。
219.如权利要求217或218所述的方法，其中所得缓冲液包含tris。
220.如权利要求217-219中任一项所述的方法，其中所得缓冲液包含edta。
221.如权利要求214-220中任一项所述的方法，其中在分离至储存缓冲液中之后进行缓冲液交换，其中所述储存缓冲液包含1mm柠檬酸钠，ph 6.5。
222.如权利要求184-221中任一项所述的方法，其包括在所述分离后过滤所述环状rna。
