本公开涉及使用天然无不利因素(liability)互补决定区(cdr)靶向抗原或抗原表位的抗体的抗体亲和力成熟。
背景技术：
1、单克隆抗体的质量通常通过其对靶抗原的亲和力来测量。因此，开发治疗性抗体的常见步骤是在假设更高的亲和力将导致更高的药物效力的基础上，将选定的先导提交给亲和力成熟活动。
2、活动遵循三个基本步骤：(1)多样化、(2)选择和(3)验证，并且许多成功的方法已经被使用。多样化已经通过如易错pcr(gram,marconi等人,1992、daugherty,chen等人,2000)、链改组(marks,griffiths等人,1992、park,lee等人,2000、lou,geren等人,2010)、靶向cdr突变(yang,green等人,1995、schier,bye等人,1996、schier和marks 1996、rajpal,beyaz等人,2005、barderas,desmet等人,2008、tiller,chowdhury等人,2017)和其它(low,holliger等人,1996、boder,midelfort等人,2000)等技术实现，并且通常会产生一些具有较高亲和力的变体，以及许多具有不变或较低亲和力的变体。通过使用展示平台，如噬菌体(yang,green等人,1995、schier和marks 1996、schier,mccall等人,1996、lamdan,gavilondo等人,2013)、酵母(boder,midelfort等人,2000、tiller,chowdhury等人,2017)或核糖体展示(hanes,jermutus等人,1998、hanes,schaffitzel等人,2000、chan,jenkinson等人,2020)和选择性压力的应用，具有改进的亲和力的新变体可以与其余变体分离。最后，产生的群体可以进行另外轮次的多样化和选择，或进行亲和力验证的单个克隆。
3、虽然这些多样化技术在创造具有改进的亲和力的分子方面是有效的，但其通常会给下游开发带来挑战。例如，经生物验证的正在成熟的先导必须保留相同的表位：攻击性随机化策略(如链改组)可能导致表位漂移(ohlin,owman等人,1996)而不是增加效力，这可能导致生物活性的丧失。整个vh或vl结构域的随机突变将不可避免地使与抗原结合无关的区发生突变，并且可能产生可开发性差的不稳定分子(julian,lee等人,2015)。在cdr内插入简并序列也是如此，这可能导致由非天然序列引起的不稳定抗体，从而引起协方差异常状态(covariance violation)，这可能影响整体抗体结构(chou,némethy等人,1989、du,wei等人,2003)。
4、此外，这些技术都没有解决序列不利因素的问题，如糖基化、天冬酰胺脱酰胺、天冬氨酸异构化、易于聚集的基序等，这可能会对药物开发产生负面影响。
技术实现思路
1、本公开至少部分基于使用基本上无不利因素的天然互补决定区(cdr)的抗体亲和力成熟的改进的方法。cdr是天然的，并且源自对重排的抗体基因的测序。进一步筛选这些cdr的成员序列不利因素，所述成员序列不利因素可能对来自表达的轻链和表达的携带这些cdr的重链的组装的抗体的可开发性产生负面影响。在组装本文所设想的抗体文库时，不考虑具有这些不利因素的cdr。将剩余天然无不利因素cdr组合并组装成抗体，并且与对照、亲代抗体相比，筛选提高的抗原结合亲和力，提高亲和力可以在约皮摩尔结合亲和力的范围内。
2、因此，本公开的一方面提供了一种包括多种抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括以下cdr序列：vh-cdr1序列、vh-cdr2序列、vh-cdr3序列、vl-cdr1序列、vl-cdr2序列和vl-cdr3序列，其中所述cdr序列中的两个或更多个cdr序列对于所述多种抗体中的每种抗体是相同的(“不变cdr序列”)；并且其中剩余cdr序列中的每个剩余cdr序列包括源自在天然存在的抗体中发现的所述cdr的序列的多个独特cdr(“变体cdr序列”)。“天然存在的抗体”意指不反映抗体工程化或其它基因工程化的抗体。
3、在一些实施例中，两个或更多个不变cdr序列可以选自由以下组成的组：(i)vl-cdr3、vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3；(ii)vl-cdr1、vl-cdr2、vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3；(iii)vl-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3和vh-cdr3；(iv)vl-cdr1、vl-cdr2和vh-cdr3；以及(v)vl-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3、vh-cdr1和vh-cdr2。
4、在一些实施例中，所述不变cdr序列可以源自与单个抗原或抗原表位结合的亲代抗体。
5、本公开还提供了一种包括多种抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括以下cdr序列：vh-cdr1序列、vh-cdr2序列、vh-cdr3序列、vl-cdr1序列、vl-cdr2序列和vl-cdr3序列，其中所述cdr序列中的两个或更多个cdr序列对于所述多种抗体中的每种抗体是相同的(“不变cdr序列”)；并且其中剩余cdr序列(“变体cdr序列”)中除hcdr3以外的每个剩余cdr序列包括源自在天然存在的抗体中发现的cdr的序列的多个cdr，并且所述hcdr3包括亲代hcdr3的多个变体。在一些实施例中，所述hcdr3包括所述亲代hcdr3的单一突变。
6、在一些实施例中，两个或更多个不变cdr序列可以选自由以下组成的组：(i)vl-cdr3、vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3；(ii)vl-cdr1、vl-cdr2、vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3；(iii)vl-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3和vh-cdr3；以及(iv)vl-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3、vh-cdr1和vh-cdr2。
7、在一些实施例中，所述不变cdr序列可以源自与单个抗原或抗原表位结合的亲代抗体。
8、在上文和本文所公开的任何抗体文库中，不变cdr序列可以包括以下的组合：vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3、vl-cdr1、vl-cdr2和/或vl-cdr3。在一些实施例中，不变和变体cdr序列不含以下不利因素中的一种或多种不利因素：(i)糖基化位点，(ii)脱酰胺化位点，(iii)异构化位点，(iv)未配对的半胱氨酸，(v)大于1的净电荷，(vi)含有至少两个芳香族残基的三肽基序，(vii)促进聚集的基序，(viii)多特异性位点，(ix)蛋白酶敏感位点，(x)整合素结合位点，(xi)赖氨酸糖基化位点，(xii)金属催化的片段化位点，(xiii)多特异性聚集位点，以及(xiv)链霉亲和素结合基序。
9、在一些实施例中，所述糖基化位点可以包括基序nxs、nxt或nxc，其中x表示除脯氨酸以外的任何天然存在的氨基酸残基。
10、在一些实施例中，所述脱酰胺化位点可以包括基序ng、ns、nt、nn、na、nh、nd、gnf、gny、gnt或gng。
11、在一些实施例中，所述异构化位点可以包括基序dt、dh、ds、dg或dd。
12、在一些实施例中，三肽可以是hyf或hwh。
13、在一些实施例中，所述促进聚集的基序可以包括基序fhw。
14、在一些实施例中，所述多特异性位点可以包括基序gg、ggg、rr、vg、w、wv、ww、www、yy或wxw，其中x表示任何氨基酸残基。
15、在一些实施例中，蛋白酶切割位点可以包括基序dx，其中x是p、g、s、v、y、f、q、k、l或d。
16、在一些实施例中，所述整合素结合位点可以包括rgd、ryd、ldv或kgd。
17、在一些实施例中，所述赖氨酸糖基化位点可以包括ke、ek或ed。
18、在一些实施例中，所述金属催化的片段化位点可以包括基序hs、sh、kt、hxs或sxh，其中x表示任何氨基酸残基。
19、在一些实施例中，所述多特异性聚集位点可以包括基序x1x2x3，其中x1、x2和x3中的每一个独立地选自由以下组成的组：f、i、l、v、w和y。
20、在一些实施例中，所述链霉亲和素结合基序可以包括基序hpq、epdw、pwxwl，其中x表示任何氨基酸残基、gdwvfi或pwpwlg。
21、在一些实施例中，上文和本文所公开的抗体文库中的任一个抗体文库可以是全长抗体文库、fab抗体文库、单链抗体文库或单结构域抗体文库。
22、在一些实施例中，上文和本文所公开的抗体文库中的任一个抗体文库可以是人抗体文库。
23、另一方面，本公开提供了一种用于产生抗体文库的方法，所述方法包括：(a)从由以下组成的组中选择两个或更多个cdr序列：vh-cdr1序列、vh-cdr2序列、vh-cdr3序列、vl-cdr1序列、vl-cdr2序列和vl-cdr3序列；以及(b)产生包括多种抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括以下cdr序列：(i)在(a)中选择的两个或更多个cdr序列(“不变cdr序列”)；以及(ii)未在(a)中选择的剩余cdr序列的独特组合(“变体cdr序列”)，其中所述变体cdr序列选自由以下组成的组：vh-cdr1序列、vh-cdr2序列、vh-cdr3序列、vl-cdr1序列、vl-cdr2序列和vl-cdr3序列，并且源自在天然存在的抗体中发现的cdr的序列。
24、另一方面，本公开还提供了一种用于产生抗体文库的方法，所述方法包括：(a)从由以下组成的组中选择两个或更多个cdr序列：vh-cdr1序列、vh-cdr2序列、vh-cdr3序列、vl-cdr1序列、vl-cdr2序列和vl-cdr3序列；以及(b)产生包括多种抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括以下cdr序列：(i)在(a)中选择的两个或更多个cdr序列(“不变cdr序列”)；以及(ii)未在(a)中选择的剩余cdr序列的独特组合(“变体cdr序列”)，其中所述变体cdr序列选自由以下组成的组：vh-cdr1序列、vh-cdr2序列、vh-cdr3序列、vl-cdr1序列、vl-cdr2序列和vl-cdr3序列，并且对于除vh-cdr3(hcdr3)以外的所有cdr序列，源自在天然存在的抗体中发现的cdr的序列，其中所述hcdr3包括所述亲代hcdr3的多个变体。在一些实施例中，所述hcdr3可以包括所述亲代hcdr3序列的单一突变。
25、仍另一方面，本文提供了一种用于鉴定对靶抗原或靶抗原表位具有改进的亲和力的抗体的方法，所述方法包括：(a)根据上文和本文所描述的任一种方法产生抗体文库，其中所述两个或更多个不变cdr序列源自待亲和力成熟的所述亲代抗体；以及(b)筛选所述抗体文库以分离相对于对照更紧密地与所述靶抗原或靶抗原表位结合的抗体，由此鉴定具有改进的亲和力的抗体。
26、仍另一方面，本文提供了一种用于改进与靶抗原或靶抗原表位结合的抗体的可开发性的方法，所述方法包括：(a)根据上文和本文所描述的任一种方法产生抗体文库，其中所述两个或更多个不变cdr序列源自待亲和力成熟的所述亲代抗体，并且其中所述不变cdr序列和所述变体cdr序列不含一种或多种序列不利因素；以及(b)筛选所述抗体文库以分离抗体，所述抗体相对于对照更紧密地与所述靶抗原或所述靶抗原表位结合，并且缺乏在原始抗体的所述cdr中发现的一种或多种所述序列不利因素，由此改进所述抗体的所述可开发性。
27、在一些实施例中，两个或更多个不变cdr序列可以选自由以下组成的组：(i)vl-cdr3、vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3；(ii)vl-cdr1、vl-cdr2、vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3；(iii)vl-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3和vh-cdr3；(iv)vl-cdr1、vl-cdr2和vh-cdr3；以及(v)vl-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3、vh-cdr1和vh-cdr2。
28、在一些实施例中，不变和变体cdr序列不含以下不利因素中的一种或多种不利因素：(i)糖基化位点，(ii)脱酰胺化位点，(iii)异构化位点，(iv)未配对的半胱氨酸，(v)大于1的净电荷，(vi)含有至少两个芳香族残基的三肽基序，(vii)促进聚集的基序，(viii)多特异性位点，(ix)蛋白酶敏感位点，(x)整合素结合位点，(xi)赖氨酸糖基化位点，(xii)金属催化的片段化位点，(xiii)多特异性聚集位点，以及(xiv)链霉亲和素结合基序。
29、在一些实施例中，所述糖基化位点可以包括基序nxs、nxt或nxc，其中x表示除脯氨酸以外的任何天然存在的氨基酸残基。
30、在一些实施例中，所述脱酰胺化位点可以包括基序ng、ns、nt、nn、na、nh、nd、gnf、gny、gnt或gng。
31、在一些实施例中，所述异构化位点可以包括基序dt、dh、ds、dg或dd。
32、在一些实施例中，三肽可以是hyf或hwh。
33、在一些实施例中，所述促进聚集的基序可以包括基序fhw。
34、在一些实施例中，所述多特异性位点可以包括基序gg、ggg、rr、vg、w、wv、ww、www、yy或wxw，其中x表示任何氨基酸残基。
35、在一些实施例中，蛋白酶切割位点可以包括基序dx，其中x是p、g、s、v、y、f、q、k、l或d。
36、在一些实施例中，所述整合素结合位点可以包括rgd、ryd、ldv或kgd。
37、在一些实施例中，所述赖氨酸糖基化位点可以包括ke、ek或ed。
38、在一些实施例中，所述金属催化的片段化位点可以包括基序hs、sh、kt、hxs或sxh，其中x表示任何氨基酸残基。
39、在一些实施例中，所述多特异性聚集位点可以包括基序x1x2x3，其中x1、x2和x3中的每一个独立地选自由以下组成的组：f、i、l、v、w和y。
40、在一些实施例中，所述链霉亲和素结合基序可以包括基序hpq、epdw、pwxwl，其中x表示任何氨基酸残基、gdwvfi或pwpwlg。
41、在一些实施例中，上文和本文所公开的抗体文库中的任一个抗体文库可以是全长抗体文库、fab抗体文库、单链抗体文库或单结构域抗体文库。
42、在一些实施例中，上文和本文所公开的抗体文库中的任一个抗体文库可以是人抗体文库。
43、本文所公开的抗体文库中的任一个抗体文库可以是合适的形式，例如全长抗体的文库、抗原结合片段(如fab片段)的文库、单链抗体的文库或单结构域抗体(例如，vhh抗体)的文库。在一些实例中，本文所公开的抗体文库可以是人抗体文库。在其它实例中，本文所公开的抗体文库可以是骆驼vhh抗体文库。
44、在又另一方面，本公开提供了包括多种抗体的vhh文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括以下cdr序列：cdr1序列、cdr2序列和cdr3序列，其中一个或多个所述cdr序列对于所述多种抗体中的每种抗体是相同的(不变cdr序列)；并且其中剩余cdr中的每个剩余cdr包括源自在天然存在的抗体中发现的cdr的序列的多个cdr(变体cdr)。
45、在一些实施例中，所述不变cdr序列源自与单个抗原或抗原表位结合的亲代vhh。
46、在仍又另一方面，本公开提供了包括多种抗体的vhh文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括以下cdr序列：cdr1序列、cdr2序列和cdr3序列，其中一个或多个所述cdr序列对于所述多种抗体中的每种抗体是相同的(“不变cdr序列”)；并且其中除hcdr3以外的剩余cdr中的每个剩余cdr包括源自在天然存在的抗体中发现的cdr的序列的多个cdr(“变体cdr”)，并且其中所述hcdr3包括所述亲代hcdr3的多个变体。在一些实施例中，所述hcdr3包括所述亲代hcdr3的单一突变。
47、在一些实施例中，所述不变cdr序列源自与单个抗原或抗原表位结合的亲代vhh。
48、在仍又另一方面，本公开提供了一种用于产生vhh文库的方法，所述方法包括：(a)从由以下组成的组中选择一个或多个cdr序列：cdr1序列、cdr2序列和cdr3序列；以及(b)产生包括多种抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括以下cdr序列：(i)在(a)中选择的一个或多个cdr序列(“不变cdr序列”)；和(ii)未在(a)中选择的剩余cdr序列的独特组合(“变体cdr序列”)，其中所述变体cdr序列中的每个变体cdr序列包括源自在天然存在的抗体中发现的cdr的序列的多个cdr。
49、在仍又另一方面，本公开提供了一种用于产生vhh文库的方法，所述方法包括：(a)从由以下组成的组中选择一个或多个cdr序列：cdr1序列、cdr2序列和cdr3序列；以及(b)产生包括多种抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括以下cdr序列：(i)在(a)中选择的一个或多个cdr序列(“不变cdr序列”)；和(ii)未在(a)中选择的剩余cdr序列的独特组合(“变体cdr序列”)，其中除hcdr3以外，所述变体cdr序列中的每个变体cdr序列包括源自在天然存在的抗体中发现的cdr的序列的多个cdr，并且其中所述hcdr3包括所述亲代hcdr3的多个变体。在一些实施例中，所述cdr3可以包括所述亲代hcdr3的单一突变。
50、在一些实施例中，所述cdr序列不含以下序列不利因素中的一种或多种序列不利因素：(i)糖基化位点，(ii)脱酰胺化位点，(iii)异构化位点，(iv)未配对的半胱氨酸，(v)大于1的净电荷，(vi)含有至少两个芳香族残基的三肽基序，(vii)促进聚集的基序，(viii)多特异性位点；(ix)蛋白酶敏感位点，(x)整合素结合位点，(xi)赖氨酸糖基化位点，(xii)金属催化的片段化位点，(xiii)多特异性聚集位点；以及(xiv)链霉亲和素结合基序。
51、例如，所述糖基化位点可以包括基序nxs、nxt或nxc，其中x表示除脯氨酸以外的任何天然存在的氨基酸残基；所述脱酰胺化位点可以包括基序ng、ns、nt、nn、na、nh、nd、gnf、gny、gnt或gng；其中所述异构化位点可以包括基序dt、dh、ds、dg或dd；三肽是hyf或hwh；所述促进聚集的基序可以包括基序fhw；所述多特异性位点可以包括基序gg、ggg、rr、vg、w、wv、ww、www、yy或wxw，其中x表示任何氨基酸残基；所述蛋白酶切割位点可以包括基序dx，其中x是p、g、s、v、y、f、q、k、l或d；所述整合素结合位点可以包括rgd、ryd、ldv或kgd；所述赖氨酸糖基化位点包括ke、ek或ed；所述金属催化的片段化位点可以包括基序hs、sh、kt、hxs或sxh，其中x表示任何氨基酸残基；所述多特异性聚集位点可以包括基序x1x2x3，其中xi、x2和x3中的每一个独立地选自由以下组成的组：f、i、l、v、w和y；并且所述链霉亲和素结合基序可以包括基序hpq、epdw、pwxwl，其中x表示任何氨基酸残基、gdwvfi或pwpwlg。
52、在以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征或优点从以下附图和若干个实施例的详细说明以及还从所附权利要求中将变得显而易见。
1.一种包括多种抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括以下cdr序列：
2.根据权利要求1所述的抗体文库，其中所述两个或更多个不变cdr序列选自由以下组成的组：
3.一种包括多种抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括以下cdr序列：
4.根据权利要求3所述的抗体文库，其中所述两个或更多个不变cdr序列选自由以下组成的组：
5.根据权利要求3或4所述的抗体文库，其中选自所述文库的抗体相对于亲代抗体与靶抗原或靶抗原表位更紧密地结合。
6.一种包括多种抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括：
7.根据权利要求5至6中任一项所述的抗体文库，其中所述hcdr3包括所述亲代hcdr3的单一突变。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体文库，其中所述不变cdr序列包括以下的组合：vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3、vl-cdr1、vl-cdr2和/或vl-cdr3。
9.根据权利要求1至8所述的抗体文库，其中所述变体cdr序列不含以下不利因素(liability)中的一种或多种不利因素：
10.根据权利要求9所述的抗体文库，其中所述糖基化位点包括基序nxs、nxt或nxc，其中x表示除脯氨酸以外的任何天然存在的氨基酸残基；其中所述脱酰胺化位点包括基序ng、ns、nt、nn、na、nh、nd、gnf、gny、gnt或gng；其中所述异构化位点包括基序dt、dh、ds、dg或dd；其中三肽是hyf或hwh；其中所述促进聚集的基序包括基序fhw；其中所述多特异性位点包括基序gg、ggg、rr、vg、w、wv、ww、www、yy或wxw，其中x表示任何氨基酸残基；其中蛋白酶切割位点包括基序dx，其中x是p、g、s、v、y、f、q、k、l或d；其中所述整合素结合位点包括rgd、ryd、ldv或kgd；其中所述赖氨酸糖基化位点包括ke、ek或ed；其中所述金属催化的片段化位点包括基序hs、sh、kt、hxs或sxh，其中x表示任何氨基酸残基；其中所述多特异性聚集位点包括基序x1x2x3，其中xi、x2和x3中的每一个独立地选自由以下组成的组：f、i、l、v、w和y；和/或其中所述链霉亲和素结合基序包括基序hpq、epdw、pwxwl，其中x表示任何氨基酸残基、gdwvfi或pwpwlg。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体文库，其中所述抗体文库是全长抗体文库、fab抗体文库、单链抗体文库或单结构域抗体文库。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体文库，其中所述抗体文库是人抗体文库。
13.一种用于产生抗体文库的方法，所述方法包括：
14.一种用于产生抗体文库的方法，所述方法包括：
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述hcdr3包括所述亲代hcdr3序列的单一突变。
16.一种用于产生抗体文库的方法，所述方法包括：
17.一种用于鉴定对靶抗原或靶抗原表位具有改进的亲和力的抗体的方法，所述方法包括：
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括以下另外的步骤：
19.一种用于改进抗体的可开发性的方法，所述方法包括：
20.根据权利要求17或19所述的方法，其中所述对照是亲代抗体。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述两个或更多个不变cdr序列选自由以下组成的组：
22.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中所述不变cdr序列和所述变体cdr序列不含以下不利因素中的一种或多种不利因素：
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述糖基化位点包括基序nxs、nxt或nxc，其中x表示除脯氨酸以外的任何天然存在的氨基酸残基；其中所述脱酰胺化位点包括基序ng、ns、nt、nn、na、nh、nd、gnf、gny、gnt或gng；其中所述异构化位点包括基序dt、dh、ds、dg或dd；其中三肽是hyf或hwh；其中所述促进聚集的基序包括基序fhw；其中所述多特异性位点包括基序gg、ggg、rr、vg、w、wv、ww、www、yy或wxw，其中x表示任何氨基酸残基；其中所述蛋白酶切割位点包括基序dx，其中x是p、g、s、v、y、f、q、k、l或d；其中所述整合素结合位点包括rgd、ryd、ldv或kgd；其中所述赖氨酸糖基化位点包括ke、ek或ed；其中所述金属催化的片段化位点包括基序hs、sh、kt、hxs或sxh，其中x表示任何氨基酸残基；其中所述多特异性聚集位点包括基序x1x2x3，其中xi、x2和x3中的每一个独立地选自由以下组成的组：f、i、l、v、w和y；和/或其中所述链霉亲和素结合基序包括基序hpq、epdw、pwxwl，其中x表示任何氨基酸残基、gdwvfi或pwpwlg。
24.根据权利要求13至23中任一项所述的方法，其中所述抗体文库是全长抗体文库、fab抗体文库、单链抗体文库或单结构域抗体文库。
25.根据权利要求13至24中任一项所述的方法，其中所述抗体文库是人抗体文库。
26.一种根据权利要求17至25中任一项所述的方法获得的抗体。
27.一种用于产生组合抗体文库的方法，所述方法包括
28.一种包括多种抗体的vhh文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括以下cdr序列：
29.根据权利要求28所述的vhh文库，其中所述文库中的每种抗体相对于对照与靶抗原或靶抗原表位更紧密地结合。
30.一种包括多种抗体的vhh文库，其中所述多种抗体中的每种抗体包括以下cdr序列：
31.根据权利要求30所述的vhh文库，选自所述文库的抗体相对于亲代抗体与靶抗原或靶抗原表位更紧密地结合。
32.根据权利要求30或31所述的vhh文库，其中所述hcdr3序列包括所述亲代hcdr3序列的单一突变。
33.一种用于产生vhh文库的方法，所述方法包括：
34.一种用于产生vhh文库的方法，所述方法包括：
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述cdr3序列包括所述亲代hcdr3序列的单一突变。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述不变cdr序列和所述变体cdr序列不含以下不利因素中的一种或多种不利因素：
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述糖基化位点包括基序nxs、nxt或nxc，其中x表示除脯氨酸以外的任何天然存在的氨基酸残基；其中所述脱酰胺化位点包括基序ng、ns、nt、nn、na、nh、nd、gnf、gny、gnt或gng；其中所述异构化位点包括基序dt、dh、ds、dg或dd；其中三肽是hyf或hwh；其中所述促进聚集的基序包括基序fhw；其中所述多特异性位点包括基序gg、ggg、rr、vg、w、wv、ww、www、yy或wxw，其中x表示任何氨基酸残基；其中所述蛋白酶切割位点包括基序dx，其中x是p、g、s、v、y、f、q、k、l或d；其中所述整合素结合位点包括rgd、ryd、ldv或kgd；其中所述赖氨酸糖基化位点包括ke、ek或ed；其中所述金属催化的片段化位点包括基序hs、sh、kt、hxs或sxh，其中x表示任何氨基酸残基；其中所述多特异性聚集位点包括基序x1x2x3，其中xi、x2和x3中的每一个独立地选自由以下组成的组：f、i、l、v、w和y；和/或其中所述链霉亲和素结合基序包括基序hpq、epdw、pwxwl，其中x表示任何氨基酸残基、gdwvfi或pwpwlg。
