克氏原螯虾体内组织的内参基因及其引物

1.本发明属于分子生物学技术领域，涉及水产动物病害防治，具体涉及克氏原螯虾感染wssv后不同时间、不同药物处理、不同组织的最适内参基因的筛选方法及其引物和应用。


背景技术：

2.克氏原螯虾（procambarus clarkii）俗名小龙虾，属节肢动物门arthropoda、甲壳纲crustacea、十足目decapoda、鳌虾科cambaridae。原产于美国，20世纪30年代至40年代引入中国，初期作为入侵物种对环境产生较大危害，后经驯化成为水产经济动物。目前在全国各地都有广泛养殖且规模日益增大。2019年克氏原螯虾产值已突破4000亿元，“十三五”以来，据不完全统计，2016～2020年各类机构共授予了17个小龙虾区域品牌。在国家和各地政策的大力扶持，小龙虾产业规模扩张的趋势还存在强大的惯性，在“十四五”时期小龙虾产业整体还将维持中高速增长。
3.白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，wssv）是一种环状双链的dna病毒，病毒粒子为卵圆形或杆状，病毒结构由囊膜和核衣壳组成，是迄今对包括小龙虾和对虾在内的甲壳类动物养殖业危害最大的一种病毒。在1992年，wssv首次被发现于中国台北对虾养殖场，随后迅速扩散至亚洲各国。wssw能够进行水平传播、垂直传播和种间传播，传染能力强，死亡率高。其对小龙虾的感染最早见于2006年5月的浙江省舟山，后续几年在湖北、江苏、浙江等小龙虾养殖大省均见报道。现在已成为威胁小龙虾产业健康发展的一种重要病害。
4.实时荧光定量pcr（rt-qpcr）技术是一种常见的分子生物学方法，广泛用于精确测定目的基因的表达量，但其精确度高度依赖于所选择的内参基因，内参基因的稳定性和表达丰度是选取最适内参基因的关键因素。研究表明，不同环境、不同刺激、不同阶段等条件下内参基因的表达情况会发生改变，且不同组织的最适内参基因并不完全相同。鉴于克氏原螯虾在感染wssv不同时间（阶段）、不同药物处理、不同组织的内参基因尚未见报道，为进一步研究wssv感染对克氏原螯虾体内组织的相关功能基因表达的影响，有必要对克氏原螯虾感染wssv病毒后的内参基因进行筛选。


技术实现要素：

5.本发明目的之一在于提供克氏原螯虾感染wssv病毒不同时间（阶段）、不同药物处理、不同组织的最适内参基因。本发明目的之二在于提供所述最适内参基因的引物。本发明目的之三在于提供最适内参基因及其引物在基因表达中的应用。
6.基于本发明上述目的的实现，本发明可以满足实时荧光定量pcr分析克氏原螯虾体内组织目的基因转录表达水平的要求，为克氏原螯虾感染wssv时体内组织相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据。
7.为实现发明上述目的，解决现有问题，本发明采用的技术方案为：克氏原螯虾感染
白斑综合征病毒后体内组织的内参基因为eif基因和tbp基因，所述eif基因的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述tbp基因的核苷酸序列如seq id no.7所示。
8.进一步地，所述eif基因的引物：正向核苷酸序列为5
’‑
ggaataaggggacgaagacc-3’；反向核苷酸序列为5
’‑
gcaaacacacgctgggat-3’。
9.进一步地，所述tbp基因的引物：正向核苷酸序列为5
’‑
aaggaaatacgctcggattg-3’；反向核苷酸序列为5
’‑
ctggctgtgagtgaggacaa-3’。
10.本发明给出了克氏原螯虾在感染wssv后体内组织鳃、肌肉、脑、肝脏、肠道、性腺的内参基因筛选过程描述及结果。
11.另外，本发明还提供了克氏原螯虾感染白斑综合征病毒后体内组织的内参基因eif、tbp及其引物在基因表达中的应用。作为本发明所述应用的优选实施方式，所述内参基因eif、tbp及其引物用于荧光定量pcr分析。
12.与现有技术相比，本发明具有下述的有益效果或优点：对现有技术的贡献之一在于，本发明选择了18s rrna，gapdh，actb，ef1α，ub，tub，tbp，eif等8个常用的内参基因作为克氏原螯虾不同组织的候选内参基因，通过genorm、normfinder、bestkeeper、delta ct和reffinder等5种算法评估候选内参基因的稳定性，获得了适用于克氏原螯虾感染wssv不同阶段、不同药物处理、不同组织的最适内参基因eif、tbp。
13.对现有技术的贡献之二在于，本发明根据内参基因并设计了候选内参基因的荧光定量pcr引物，该引物特异性强，扩增效率高，填补了克氏原螯虾感染wssv不同阶段、不同药物处理、不同组织没有共同内参基因的现状。
14.对现有技术的贡献之三在于，本发明为克氏原螯虾感染wssv时不同组织的相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据，为功能基因的挖掘奠定必要的前期基础，同时可提高功能基因研究的重复性、稳定性和可靠性。
附图说明
15.图1为实施例1中8个内参基因（18s rrna，gapdh，actb，ef1α，ub，tub，tbp，eif）在荧光定量rt-qpcr反应中的溶解曲线。
16.图2为实施例1中克氏原螯虾组织（鳃、肌肉、脑、肝脏、肠道、性腺）的8个候选内参基因在wssv不同感染阶段的ct值分布情况。
17.图3为实施例1中genorm算法中的成对变异值vn/v
n+1
图。
18.图4为实施例1中克氏原螯虾肝脏组织gst基因以内参基因（eif、tbp和eif+tbp）校准前后的相对表达水平及gst酶活性变化趋势。
19.图5为实施例2中8个内参基因（18s rrna，gapdh，actb，ef1α，ub，tub，tbp，eif）在荧光定量rt-qpcr反应中的溶解曲线。
20.图6为实施例2中克氏原螯虾组织（鳃、肌肉、脑、肝脏、肠道、性腺）的8个候选内参基因在wssv不同感染阶段的ct值分布情况。
21.图7为实施例2中genorm算法中的成对变异值vn/v
n+1
图。
22.图8为实施例2中克氏原螯虾肝脏组织gst基因以内参基因（eif、tbp和eif+tbp）校准前后的相对表达水平及gst酶活性变化趋势。
具体实施方式
23.下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
24.实施例1本实施例给出克氏原螯虾感染wssv不同时间不同组织最适内参基因的筛选方法及结果。
25.1、供试材料选择健康、体重基本一致的克氏原螯虾（17.07
±
2.15g）为供试水产养殖动物，28℃饲养于30l的水缸中，一天喂两次饲料直至正式实验。实验组每只虾按100μl注射wssv病毒液（用含5%牛胚胎血清的l-15培养基作为溶剂配制），分别于注射后24h、48h、72h取样，对照组为未注射wssv病毒液的健康克氏原螯虾。每组虾在无菌条件下解剖取得鳃、肌肉、脑、肝脏、肠道、性腺等6个不同组织。
26.2、克氏原螯虾总rna提取和cdna合成根据rnaex pro reagent (accurate biology, changsha, china)试剂盒说明书对不同组织进行总rna提取，提取的rna通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计鉴定质量和浓度。使用无核酸酶水调节rna浓度至1.0μg/μl，进行后续cdna合成。cdna合成遵照hiscript
®ꢀ
iii rt supermix for qpcr (+gdna wiper) (vazyme biotech, nanjing, china)试剂盒说明书。cdna产物保存在-20℃。
27.总rna提取及引物特异性检验得出，样品的总rna均满足od
260
/od
280
》1.8且od
260
/od
230
》2.0，表明提取的总rna完整无降解。
28.3、内参基因选择和引物设计候选内参基因选择18s rrna（核苷酸序列如seq id no.1所示）、gapdh（核苷酸序列如seq id no.2所示）、actb（核苷酸序列如seq id no.3所示）、ef1α（核苷酸序列如seq id no.4所示）、ub（核苷酸序列如seq id no.5所示）、tub（核苷酸序列如seq id no.6所示）、tbp（核苷酸序列如seq id no.7所示）、eif（核苷酸序列如seq id no.8所示）等8个常用的内参基因。另外选择gst（核苷酸序列如seq id no.9所示）作为用于验证候选内参基因的目的基因，根据ncbi genbank中公布的序列设计相应的引物（表1）并由生工生物公司合成。利用pcr检测引物特异性，引物的要求应满足扩增条带只在预期的地方出现且无其他杂带。进一步通过rt-qpcr检测引物的特异性与扩增效率，选择单一峰，扩增效率高且阴性对照无峰的引物作为最终引物。
29.表1，内参基因及其引物序列
4、实时荧光定量pcr实时荧光定量pcr在lightcycler 480 real-time pcr system (roche diagnostics)中进行。各组织设置3个重复，每个重复体系为10μl，包括1μl cdna模板，5μl chamq sybr qpcr master mix (vazyme biotech)，3μl无核酸酶水以及上、下游引物各0.5μl。反应程序为：95℃预热30s，随后40个循环（95℃持续5s，60℃持续30s，72℃持续30s）。每次pcr结束后均进行一次溶解曲线分析（55℃持续10s，然后每10s升温0.5℃至95℃），验证每次反应是否只存在单个峰。
30.图1是本发明8个常用内参基因在荧光定量rt-qpcr反应中的溶解曲线，结果显示8个内参基因的溶解曲线均为单一峰，具有较高的扩增效率，特异性较强。
31.荧光定量pcr反应中，基因的表达水平与ct值成反比，ct值越小，说明基因的表达水平越高；反之越低。ct值结果显示，不同组织中8个候选内参基因的表达水平可以分为4个不同层次（图2）：18s rrna最高（ct值最低），其次是gapdh、act、ub、eif，再次是ef1α，最后是tub和tbp基因。
32.5、内参基因稳定性评估将克氏原螯虾肝脏组织8个内参基因在wssv感染的4个不同时间点的ct值（通过荧
光定量pcr获得）整理成表，通过集合了genorm、normfinder、bestkeeper和delta ct等4种不同算法的reffinder在线程序（http://blooge.cn/reffinder/）综合分析8个内参基因在wssv感染不同时间的表达稳定性，从而筛选出不同组织的最适内参基因。reffinder在线程序会分别列出genorm、normfinder、bestkeeper和delta ct等4种不同算法下的8个内参基因的稳定性排名，然后根据每种算法的排名，软件会给每个基因分配一个适当的权重，并计算它们的权重的几何平均值，最终获得reffinder的综合排名。
33.应用genorm、normfinder、bestkeeper和delta ct程序对8个候选内参基因的表达稳定性进行排序（表2），结果显示：eif基因在normfinder和delta ct程序中均排名第一，在genorm和bestkeeper程序中排名第三，稳定性较高，reffinder综合排名显示eif排名第一，可以认为eif是最稳定的内参基因。
34.表2，内参基因的稳定性及其排名此外，通过genorm成对变异值vn/v
n+1
分析合适的内参基因个数，当n从小到大，vn/v
n+1
《0.15时，表示需要的内参基因个数为n个，当vn/v
n+1
》0.15时，表示需要的内参基因个数为n+1个。如图3所示，v2/v3=0.038《0.15，说明最佳内参基因数为2。结合reffinder的综合排名可以得出结论：eif和tbp是克氏原螯虾感染wssv时不同组织的最适内参基因。
35.eif基因的核苷酸序列如seq id no.8所示；tbp基因的核苷酸序列如seq id no.7所示。内参基因eif的荧光定量pcr引物，正向引物：5
’‑
ggaataaggggacgaagacc-3’；eif反向引物：5
’‑
gcaaacacacgctgggat-3’。内参基因tbp的荧光定量pcr引物，tbp正向引物：5
’‑
aaggaaatacgctcggattg-3’；tbp反向引物：5
’‑
ctggctgtgagtgaggacaa-3’。
36.6、最适内参基因的验证谷胱甘肽—s转移酶（glutathione s-transferase，gst）是一类与肝脏解毒相关的酶，在肝脏中存在量很大，其酶活测定又有相应的商品化检测试剂盒。因此，本实施例中，以肝脏组织中的gst基因为目的基因进行上述预测的最适内参基因验证。
37.以上述分析所得的最适内参基因作为荧光定量pcr的内参基因（如果最适内参基因是多个，则取多个内参基因的几何平均值），通过2
‑△△
ct
法，计算wssv不同感染时期肝脏组织中的gst基因的相对表达水平。同时，在解剖获取克氏原螯虾肝脏组织时，取部分肝脏组织制备组织匀浆，收集匀浆上清液，用于gst（谷胱甘肽—s转移酶）活性检测，检测方法采用
比色法依据谷胱甘肽—s转移酶（gsh-st）试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书进行，具体步骤参照表3和表4。
38.表3，酶促反应表4，显色反应将表3各物质混匀，3500～4000转/分，离心10分钟，取上清液作显色反应。表4所示物质混匀后室温放置15分钟，1cm光径，双蒸水调零，412nm测各管od值。将wssv感染不同时间点肝组织gst测得的od值，分别与0h的od值做对比，获得各时间点gst酶活性的相对水平和变化趋势，并将其与肝组织gst基因以内参基因校准前和校准后的相对表达水平进行比较分析，从而验证候选最适内参基因。
39.选用肝脏组织的gst基因为目的基因，以同样的方式进行一次荧光定量pcr，分别以eif、tbp和eif+tbp为内参基因，进行gst表达水平分析，获得wssv不同感染时期gst的表达情况，再与wssv感染不同时期肝脏组织的gst活性进行比较。结果显示：未采用内参基因校准时，gst表达水平在感染后持续上升，峰值位于72h处（图4）。而采用内参基因进行校准后，gst表达水平变化趋势与gst酶活性曲线趋势呈现一致，即均在感染后48h达到峰值，在72h时有所下降，以上数据说明本实施例的结果可靠。
40.实施例2本实施例给出克氏原螯虾感染wssv后不同药物处理时不同组织的最适内参基因的筛选方法及结果。
41.1、供试材料
克氏原螯虾的选择、饲养及组织解剖等操作同实施例1。与实施例1不同的是，克氏原螯虾的处理分组参见表5。表5中，“w”表示wssv病毒液，“m”表示苦参碱溶液。pbs（ph=7.4）配方：磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠1.44g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，加水至1000ml。wssv病毒液的制备方法：病毒原液用含5%牛胚胎血清的l-15培养基作为溶剂配制，使用时用tm（100 mm tris-hcl, 10 mm mgcl2, ph=7.5）缓冲液稀释至所需量。matrine溶液（初始浓度为50mg/ml）的制备方法：取50mg matrine溶解于1ml dmso溶液（二甲基亚砜，ar≥99.5%）。wssv+matrine混合液的配制：100μl注射溶液包含：10μl稀释后的病毒液；20μl matrine溶液（原溶液为50mg/ml，克氏原螯虾为20g/只，注射有效浓度为50mg/kg虾时）；70μl tm溶液。先wssv，后matrine表示：先注射50μl wssv病毒液，24h后再注射50μl matrine溶液。先matrine，后wssv表示：先注射50μl matrine溶液，24h后再注射50μl wssv病毒液。
42.表5，克氏原螯虾处理分组2、克氏原螯虾总rna提取和cdna合成克氏原螯虾总rna提取和cdna合成等操作同实施例1。
43.总rna提取及引物特异性检验得出，样品的总rna均满足od
260
/od
280
》1.8且od
260
/od
230
》2.0，表明提取的总rna完整无降解。
44.3、内参基因选择和引物设计内参基因选择和引物设计等操作同实施例1。内参基因及其引物序列同实施例1的表1。
45.4、实时荧光定量pcr实时荧光定量pcr操作同实施例1。
46.图5为本实施例中8个内参基因（18s rrna，gapdh，actb，ef1α，ub，tub，tbp，eif）在荧光定量rt-qpcr反应中的溶解曲线。结果显示8个内参基因的溶解曲线均为单一峰，具有较高的扩增效率，特异性较强。
47.图6为本实施例中克氏原螯虾组织（鳃、肌肉、脑、肝脏、肠道、性腺）的8个候选内参基因在wssv不同感染阶段的ct值分布情况。荧光定量pcr反应中，基因的表达水平与ct值成反比，ct值越小，说明基因的表达水平越高；反之越低。ct值结果显示，不同组织中8个候选内参基因的表达水平可以分为3个不同层次：18s rrna最高（ct值最低），其次是gapdh、act、ef1α、ub、eif，最后是tub和tbp基因。
48.5、内参基因稳定性评估内参基因稳定性评估操作同实施例1。应用genorm、normfinder、bestkeeper和delta ct程序对8个候选内参基因的表达稳定性进行排序（表6），结果显示：eif基因在
normfinder和delta ct程序中均排名第一，在bestkeeper程序中排名第三，稳定性较高，reffinder综合排名显示eif排名第一，可以认为eif是最稳定的内参基因。
49.表6，不同药物处理方式下克氏原螯虾内参基因的稳定性及其排名此外，通过genorm成对变异值vn/v
n+1
分析合适的内参基因个数，当n从小到大，vn/v
n+1
《0.15时，表示需要的内参基因个数为n个，当vn/v
n+1
》0.15时，表示需要的内参基因个数为n+1个。结果显示：6个组织的v2/v3值均小于0.15（图7），说明6个组织的最佳内参基因数均为2。结合reffinder的综合排名可以得出结论：eif和tbp是克氏原螯虾wssv病毒感染后不同药物处理时不同组织通用的最适内参基因。
50.eif基因的核苷酸序列如seq id no.8所示；tbp基因的核苷酸序列如seq id no.7所示。内参基因eif的荧光定量pcr引物，正向引物：5
’‑
ggaataaggggacgaagacc-3’；eif反向引物：5
’‑
gcaaacacacgctgggat-3’。内参基因tbp的荧光定量pcr引物，tbp正向引物：5
’‑
aaggaaatacgctcggattg-3’；tbp反向引物：5
’‑
ctggctgtgagtgaggacaa-3’。
51.6、最适内参基因的验证最适内参基因的验证操作同实施例1。
52.选用肝脏组织的gst基因为目的基因，以同样的方式进行一次荧光定量pcr，分别以eif、tbp和eif+tbp为内参基因，进行gst表达水平分析，获得克氏原螯虾wssv病毒感染后不同药物处理时肝脏gst的表达情况，再与肝脏gst酶活性进行比较。结果显示：未采用内参基因校准时，gst表达水平峰值位于w-m组（图8）。而采用内参基因进行校准后，gst表达水平变化趋势与gst酶活性曲线趋势呈现一致，即均在w+m组达到峰值，以上数据说明本实施例的结果可靠。
53.如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

技术特征：
1.克氏原螯虾感染白斑综合征病毒后体内组织的内参基因，其特征在于，所述内参基因为eif基因和tbp基因，所述eif基因的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述tbp基因的核苷酸序列如seq id no.7所示。2.根据权利要求1所述的内参基因，所述eif基因的引物：正向核苷酸序列为5
’‑
ggaataaggggacgaagacc-3’；反向核苷酸序列为5
’‑
gcaaacacacgctgggat-3’。3.根据权利要求1所述的内参基因，所述tbp基因的引物：正向核苷酸序列为5
’‑
aaggaaatacgctcggattg-3’；反向核苷酸序列为5
’‑
ctggctgtgagtgaggacaa-3’。4.根据权利要求1-3任一项所述的内参基因，其特征在于，所述克氏原螯虾的体内组织为鳃、肌肉、脑、肝脏、肠道、性腺。5.权利要求1所述的内参基因eif、tbp在基因表达中的应用。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述内参基因eif、tbp用于荧光定量pcr分析。

技术总结
本发明公开了克氏原螯虾感染白斑综合征病毒后体内组织的内参基因。所述内参基因为EIF基因和TBP基因，EIF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，TBP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。本发明还设计了内参基因的引物，该引物特异性强，扩增效率高。本发明填补了克氏原螯虾感染WSSV不同时期、不同药物处理、不同组织没有稳定内参基因的技术空白，为克氏原螯虾感染WSSV条件下各组织相关功能基因的表达定量提供了可靠的分析依据。定量提供了可靠的分析依据。定量提供了可靠的分析依据。


技术研发人员：王二龙 王高学 杜辉 刘天强 凌飞 刘韬 刘佳 陈诚
受保护的技术使用者：西北农林科技大学深圳研究院
技术研发日：2022.03.21
技术公布日：2022/4/15