针对程序性细胞死亡蛋白配体-1(PD-L1)的抗体及其用途的制作方法

针对程序性细胞死亡蛋白配体
‑
1(pd
‑
l1)的抗体及其用途
【技术领域】
1.本发明涉及一种针对pd
‑
l1(程序性死亡配体1)的抗体或其抗原结合片段、一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸、一种包含所述核酸的载体、一种用所述载体转染的细胞、一种产生所述抗体或其抗原结合片段的方法、一种用于预防或治疗癌症的包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物、以及一种用于预防或治疗癌症的组合疗法的包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物。


背景技术：

2.pd
‑
l1是1型跨膜蛋白，其具有在胞外区内的两个ig样结构域、一个跨膜结构域和一个短胞质结构域。所述胞质结构域没有已知的信号转导基序，这表明pd
‑
l1没有用于与其受体相互作用的信号传导。pd
‑
l1的分子量为40kda(290个氨基酸)，并且由小鼠19号染色体和人9号染色体上的cd274基因编码。pd
‑
l1是b7蛋白家族的成员，并且与b7.1和b7.2具有约20％氨基酸序列同一性。人pd
‑
l1与鼠和食蟹猴直系同源物的pd
‑
l1分别具有70％和93％的氨基酸同一性。
3.pd
‑
l1与其受体pd
‑
1以770nm的亲和力(kd)结合。pd
‑
1在激活的t细胞、b细胞和骨髓细胞上表达，并调节细胞免疫应答的激活或抑制。细胞中的pd
‑
l1表达可以介导针对细胞毒性t淋巴细胞(ctl)死亡的保护，这是一种在病毒感染期间钝化慢性免疫应答的调节机制。癌症(如慢性和促炎性疾病)通过上调pd
‑
l1表达来破坏免疫保护途径，从而逃避宿主免疫应答。在主动免疫应答中，ifnγ也上调pd
‑
l1的表达。
4.pd
‑
l1还通过与另一种蛋白质b7.1(也称为cd80)的相互作用介导免疫抑制，从而阻断通过cd28将激活的次级信号之一传递给t细胞的能力。鉴于肿瘤细胞上的pd
‑
l1表达和与b7.1的接合，这种特异性相互作用在肿瘤免疫抗性中的相关性仍不清楚。
5.人体的免疫功能在抗原识别的同时通过控制共刺激和共抑制信号来调节t淋巴细胞的整体功能。这种调节机制被称为免疫检查点。人体的免疫功能检测由于变化如肿瘤细胞中发生的突变而表达的肿瘤特异性新抗原，并借此去除肿瘤细胞或病毒感染的来源。
6.然而，一些肿瘤细胞通过改变肿瘤微环境来抑制免疫功能以避免这种免疫攻击，或通过t细胞免疫耐受或免疫编辑促进免疫逃逸。
7.作为这些逃逸策略之一，肿瘤特异性t淋巴细胞的功能通过免疫检查点功能的变化而受到抑制。具体地，通过激活肿瘤细胞中的抑制性免疫检查点，避免了肿瘤特异性t淋巴细胞的攻击。在这点上，可以通过使用针对pd
‑
1或配体pd
‑
l1的单克隆抗体抑制其功能来增强被抑制的肿瘤特异性t淋巴细胞活性和作用，从而获得抗肿瘤效果。
8.在此技术背景下，本技术的发明人已努力开发与pd
‑
l1特异性结合的抗体。因此，本发明人已开发了一种以高亲和力与pd
‑
l1结合的抗pd
‑
l1抗体，并确定所述抗pd
‑
l1抗体能够抑制pd
‑
1/pd
‑
l1复合物的形成并且因此可以理想地用作免疫肿瘤药物，从而完成本发明。


技术实现要素：

9.本发明的目的是提供针对pd
‑
l1的新型抗体或其抗原结合片段。
10.本发明的另一个目的是提供编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
11.本发明的仍另一个目的是提供包含所述核酸的载体、用所述载体转染的细胞及其产生方法。
12.本发明的又另一个目的是提供用于预防或治疗癌症或感染性疾病的组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段。
13.本发明的仍又另一个目的是提供用于通过将所述抗体或其抗原结合片段与另一种抗癌剂组合施用来预防或治疗癌症的组合疗法的组合物。
14.为实现上述目的，本发明提供了一种与pd
‑
l1结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含含有与seq id no:1的序列具有至少90％序列同源性的序列的重链cdr1；含有与seq id no:2的序列具有至少90％序列同源性的序列的重链cdr2；含有与seq id no:3或seq id no:11的序列具有至少90％序列同源性的序列的重链cdr3；含有与seq id no:5或seq id no:13的序列具有至少90％序列同源性的序列的轻链cdr1；含有与seq id no:6的序列具有至少90％序列同源性的序列的轻链cdr2；以及含有与seq id no:7的序列具有至少90％序列同源性的序列的轻链cdr3。
15.另外，本发明提供了一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
16.另外，本发明提供了一种包含所述核酸的载体。
17.另外，本发明提供了一种用所述载体转染的细胞。
18.另外，本发明提供了一种产生所述抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括(a)培养上述细胞和(b)从培养的细胞纯化抗体或其抗原结合片段。
19.另外，本发明提供了一种用于预防或治疗癌症的包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分的组合物。
20.另外，本发明提供了一种用于通过将所述抗体或其抗原结合片段与另一种抗癌剂组合施用来预防或治疗癌症的组合疗法的组合物。
【附图说明】
21.图1显示了用于验证通过噬菌体展示实验获得的单独抗体克隆(约1400个)在pd
‑
l1抗原蛋白上的结合的elisa反应的结果；
22.图2显示了针对293t细胞进行的代表性抗体克隆的facs实验的结果，在所述细胞中人pd
‑
l1基因在其表面上人工表达以分析pd
‑
l1结合抗体克隆与在所述细胞表面上的抗原蛋白的结合；
23.图3显示了通过用于证实9种代表性抗体克隆的pd
‑
1/pd
‑
l1结合抑制性能的基于spr的性能评价测试得到的与仅含有pd
‑
l1抗原蛋白的溶液条件(蓝色线)相比抗体样品被包含在一起时的spr传感图的变化的验证结果；
24.图4显示了使用mifn
‑
γ处理的小鼠结肠癌细胞系mc38对igg型pd
‑
l1靶抗体候选物与小鼠pd
‑
l1蛋白的结合进行分析的结果；
25.图5显示了在候选抗体的基于细胞的体外性能验证测试中证实pd
‑
1/pd
‑
l1蛋白之间的结合抑制性能的结果；
26.图6显示了使用小鼠来源的结肠癌细胞系mc38和c57bl/6同基因小鼠模型对候选抗体的体内抗癌性能进行分析的结果；
27.图7显示了证实所选择的候选抗体(kl001)增加免疫细胞活性的能力的结果；
28.图8显示了证实在候选抗体亲和力成熟后选择的kl001
‑
13候选抗体增加免疫细胞活性的能力的结果；
29.图9显示了证实取决于候选抗体的性能改善优化实验的淘选顺序的输出增加模式的结果；
30.图10显示了用于亲和力改善抗体选择的elisa反应的结果；
31.图11显示了使用biacore装置测量所选择的抗体与人pd
‑
l1和小鼠pd
‑
l1的结合的能力的结果；
32.图12显示了评价在mc38皮下同基因小鼠模型中腹膜内施用性能优化抗体“kl001
‑
13”、预优化抗体“kl001”和mpdl3280a比较抗体后肿瘤生长抑制功效的结果；
33.图13显示了使用基于细胞的体外测定测量所选择的抗体的ic50值的结果；
34.图14显示了验证il
‑
2和kl001
‑
13抗体或mpdl3280a比较抗体的组合治疗的体内抗癌效果的结果；
35.图15显示了验证ctla
‑
4抗体(9d9)和kl001
‑
13抗体或mpdl3280a比较抗体的组合治疗的体内抗癌效果的结果；
36.图16显示了除imgt编号方案外使用不同编号方案时根据本发明的抗体的cdr的序列；以及
37.图17显示了根据本发明的抗体对人、小鼠、猴和狗的交叉反应性。
【具体实施方式】
38.除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。通常，本文中使用的命名法是本领域熟知的并且是典型的。
39.在一个方面，本发明涉及一种与pd
‑
l1结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含含有如下序列的重链cdr1，所述序列与seq id no:1的序列具有至少90％序列同源性；含有如下序列的重链cdr2，所述序列与seq id no:2的序列具有至少90％序列同源性；含有如下序列的重链cdr3，所述序列与seq id no:3或seq id no:11的序列具有至少90％序列同源性；含有如下序列的轻链cdr1，所述序列与seq id no:5或seq id no:13的序列具有至少90％序列同源性；含有如下序列的轻链cdr2，所述序列与seq id no:6的序列具有至少90％序列同源性；以及含有如下序列的轻链cdr3，所述序列与seq id no:7的序列具有至少90％序列同源性。
40.如本文所用，“pd
‑
l1”是主要在激活的t细胞和b细胞上表达的免疫抑制受体“程序性死亡受体1(pd
‑
1)”的配体，并且当pd
‑
1与配体pd
‑
l1和/或pd
‑
l2结合时，抗原受体信号传导可能被负调节。pd
‑
1的配体(pd
‑
l1和pd
‑
l2)可以在多种细胞类型(包括非造血组织和各种肿瘤类型)中组成型表达或诱导。pd
‑
l1在b细胞、t细胞、骨髓细胞和树突细胞(dc)上表达，并且也在周围细胞、类似的微血管内皮细胞和非淋巴器官(如心脏、肺等)上表达。相比之下，pd
‑
l2仅发现于巨噬细胞和树突细胞上。pd
‑
1配体的表达模式可以表示pd
‑
1在维持周
围耐受中的作用，并且可以有助于调节周围中的自身反应性t细胞和b细胞应答。pd
‑
l1和pd
‑
l2是1型跨膜受体，其在胞外区域内含有igv和igc样两个结构域。两种配体都含有具有未知信号传导基序的短胞质结构域。
41.大量研究已揭示，pd
‑
1与其配体的相互作用在体外和体内抑制淋巴细胞增殖。已知阻断pd
‑
1/pd
‑
l1相互作用增加t细胞增殖和细胞因子产生并阻止细胞周期进展。阻断pd
‑
1/pd
‑
l1相互作用可以诱导增强的肿瘤特异性t细胞免疫，从而帮助免疫系统清除肿瘤细胞。此外，在慢性hiv感染后，hiv特异性cd8 t细胞功能受损，并且产生细胞因子和效应分子以及增殖它们的能力降低。pd
‑
1在感染hiv的个体的hiv特异性cd8 t细胞中高度表达，并且阻断pd
‑
1/pd
‑
l1相互作用能够改善响应于hiv肽刺激而增殖hiv特异性t细胞和产生细胞因子的能力，从而增强t细胞活性或抗病毒免疫应答。
42.如本文中所用，术语“抗体”是指与pd
‑
l1特异性结合的抗pd
‑
l1抗体。与pd
‑
l1特异性结合的完整抗体以及所述抗体分子的抗原结合片段均包括在本发明的范围内。
43.完整抗体具有含有两个全长轻链和两个全长重链的结构，所述轻链分别通过二硫键键合与所述重链连接。重链恒定区具有gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)和epsilon(ε)类型，并且还具有gamma 1(γ1)、gamma 2(γ2)、gamma 3(γ3)、gamma 4(γ4)、alpha 1(α1)和alpha 2(α2)子类。轻链恒定区具有kappa(κ)和lambda(λ)类型。
44.所述抗体或所述抗体片段的抗原结合片段是具有抗原结合功能的片段，并且包括fab、f(ab')、f(ab')2、fv等。在这些抗体片段中，fab具有含有轻链和重链可变区、轻链恒定区和第一重链恒定区(ch1)的结构，并且具有一个抗原结合位点。fab'与fab的不同之处在于fab'具有在重链ch1结构域的c末端处包含至少一个半胱氨酸残基的铰链区。
45.f(ab')2抗体是由fab'的铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键产生的。fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链fv是如下片段，在所述片段中重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接；并且单链fv(scfv)是如下片段，在所述片段中重链可变区和轻链可变区通常经由其间的肽接头通过共价键连接，或者在c末端直接连接形成二聚体结构，如所述双链fv。此类抗体片段可以使用蛋白酶来获得(例如，fab可以通过用木瓜蛋白酶限制切割完整抗体来获得，并且f(ab')2片段可以通过用胃蛋白酶限制切割完整抗体来获得)，或者可以通过基因重组技术来制备。
46.在一个实施方案中，根据本发明的抗体呈fv(例如scfv)的形式或呈完整抗体的形式。此外，所述重链恒定区可以是选自同种型如gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)和epsilon(ε)中的任何一种。例如，所述恒定区可以是γ1(igg1)、γ3(igg3)或γ4(igg4)。所述轻链恒定区可以是κ或λ类型。
47.如本文所用，术语“重链”是指包含可变区结构域vh和三个恒定区结构域ch1、ch2和ch3的全长重链及其片段，所述可变区结构域vh包含具有足以赋予对抗原的特异性的可变区序列的氨基酸序列。此外，如本文所用，术语“轻链”是指包含可变区结构域vl和恒定区结构域cl的全长轻链及其片段，所述可变区结构域vl包含具有足以赋予对抗原的特异性的可变区序列的氨基酸序列。
48.本发明的抗体的例子包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链fv(scfv)、单链抗体、fab片段、f(ab')片段、二硫键连接的fv(sdfv)、抗独特型(抗id)抗体、此类抗体的表位结合片段等。
49.单克隆抗体是从基本上同质的抗体的群体获得的抗体，其中构成所述群体的各个抗体是相同的，但可能以少量存在的天然存在的突变除外。所述单克隆抗体是高度特异性的，并且针对单个抗原位点被诱导。与典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的典型(多克隆)抗体制剂形成对照，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
50.术语“表位”是指抗体可以特异性结合的蛋白质决定簇。所述表位通常由一组化学活性表面分子(例如氨基酸或糖侧链)构成，并且通常具有特定三维结构特征和特定电荷特性。立体表位和非立体表位的区别在于在存在变性溶剂的情况下与前者的结合消失而与后者的结合不消失。
51.呈“人源化”形式的非人抗体是含有源自非人(例如鼠)免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，所述人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自接受者的高变区的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)的高变区的残基替代，所述非人物种例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。
[0052]“人抗体”是源自人免疫球蛋白的分子，并且意指构成抗体的所有氨基酸序列(包括互补决定区和结构区)由人免疫球蛋白构成。
[0053]
重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时其余一条或多条链包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，所述“嵌合”抗体与源自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体以及所述抗体的展现所需生物活性的片段中的相应序列相同或同源。
[0054]
如本文所用，“抗体可变结构域”是指抗体分子的轻链和重链部分，其包含互补决定区(cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)和框架区(fr)的氨基酸序列。vh是指重链的可变结构域，并且vl是指轻链的可变结构域。
[0055]
术语“互补决定区”(cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其对于抗原结合是必需的。每个可变结构域典型地具有三个cdr，标识为cdr1、cdr2和cdr3。
[0056]
本发明涉及一种与pd
‑
l1结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:1的序列的重链cdr1、含有seq id no:2的序列的重链cdr2、含有seq id no:3或seq id no:11的序列的重链cdr3、含有seq id no:5或seq id no:13的序列的轻链cdr1、含有seq id no:6的序列的轻链cdr2以及含有seq id no:7的序列的轻链cdr3(本专利中使用的cdr编号方案根据“imgt编号”)。根据本发明，与pd
‑
l1结合的抗体或其抗原结合片段可以包含含有seq id no:1的重链cdr1、seq id no:2的重链cdr2和seq id no:3的重链cdr3的重链可变区，或者含有seq id no:1的重链cdr1、seq id no:2的重链cdr2和seq id no:11的重链cdr3的重链可变区。
[0057]
在本发明中，与pd
‑
l1结合的抗体或其抗原结合片段可以包含含有seq id no:5的轻链cdr1、seq id no:6的轻链cdr2和seq id no:7的轻链cdr3的轻链可变区，或者含有seq id no:13的轻链cdr1、seq id no:6的轻链cdr2和seq id no:7的轻链cdr3的轻链可变区。
[0058]
[表1]
[0059]
根据本发明的抗体的cdr序列
[0060][0061]
具体地，在本发明中，与pd
‑
l1结合的抗体或其抗原结合片段可以包含：含有seq id no:1的重链cdr1、seq id no:2的重链cdr2、seq id no:3的重链cdr3的重链可变区，以及含有seq id no:5的轻链cdr1、seq id no:6的轻链cdr2和seq id no:7的轻链cdr3的轻链可变区；或者
[0062]
含有seq id no:1的重链cdr1、seq id no:2的重链cdr2和seq id no:11的重链cdr3的重链可变区；以及含有seq id no:13的轻链cdr1、seq id no:6的轻链cdr2和seq id no:7的轻链cdr3的轻链可变区。
[0063]“框架区”(fr)是除cdr残基以外的可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个fr，被鉴定为fr1、fr2、fr3和fr4。
[0064]
所述pd
‑
l1抗体是单价或二价的，并且含有单链或双链。功能上，所述pd
‑
l1抗体的结合亲和力落在10
‑5m至10
‑
12
m的范围内。例如，所述pd
‑
l1抗体的结合亲和力可以是10
‑6m至10
‑
12
m、10
‑7m至10
‑
12
m、10
‑8m至10
‑
12
m、10
‑9m至10
‑
12
m、10
‑
10
m至10
‑
12
m、10
‑
11
m至10
‑
12
m、10
‑5m至10
‑
11
m、10
‑6m至10
‑
11
m、10
‑7m至10
‑
11
m、10
‑8m至10
‑
11
m、10
‑9m至10
‑
11
m、10
‑
10
m至10
‑
11
m、10
‑5m至10
‑
10
m、10
‑6m至10
‑
10
m、10
‑7m至10
‑
10
m、10
‑8m至10
‑
10
m、10
‑9m至10
‑
10
m、10
‑5m至10
‑9m、10
‑6m至10
‑9m、10
‑7m至10
‑9m、10
‑8m至10
‑9m、10
‑5m至10
‑8m、10
‑6m至10
‑8m、10
‑7m至10
‑8m、10
‑5m至10
‑7m、10
‑6m至10
‑7m或10
‑5m至10
‑6m。
[0065]
与pd
‑
l1结合的抗体或抗原结合片段可以包含重链可变区，所述重链可变区含有与seq id no:4或seq id no:12的序列具有至少90％序列同源性的序列。与pd
‑
l1结合的抗体或抗原结合片段可以包含seq id no:4或seq id no:12的重链可变区。此外，与pd
‑
l1结合的抗体或其抗原结合片段可以包含轻链可变区，所述轻链可变区含有与seq id no:8或seq id no:14的序列具有至少90％序列同源性的序列。
[0066]
在根据本发明的具体实施方案中，可以包含seq id no:4的重链可变区和seq id no:8的轻链可变区，或者可以包含seq id no:12的重链可变区和seq id no:14的轻链可变区。
[0067]
同时，取决于其编号方案，cdr序列(区)的定义可能对于具有相同可变区的抗体略有不同。
[0068]
具体地，如以下表2中所示，即使在同一可变区中，cdr序列也可能取决于编号方案
而被不同地定义。
[0069]
[表2]
[0070]
取决于编号方案的cdr序列(区)
[0071][0072]
因此，当除imgt编号方案外还使用不同的编号方案时，根据本发明的抗体的cdr序列具有以下表3中所示的序列(图16)。
[0073]
[表3]
[0074]
取决于编号方案的根据本发明的抗体的cdr序列(区)
[0075][0076]
在一个实施方案中，根据本发明的抗体展现出对人和小鼠的交叉反应性，以及在人和除人以外的哺乳动物中的交叉反应性。具体地，除人以外的哺乳动物可以是猴或狗(图17)。如其中所用，术语“噬菌体展示”是用于展示变体多肽的技术，所述变体多肽作为与噬菌体例如丝状噬菌体颗粒的表面上的包膜蛋白的至少一部分的融合蛋白。噬菌体展示的有用性在于，其可以在大型随机化蛋白质变体文库中快速且有效地对以高亲和力与靶抗原结合的序列进行分类。在噬菌体上展示肽和蛋白质文库已经用于筛选数百万个多肽，以鉴定具有特异性结合特性的多肽。
[0077]
噬菌体展示技术已被证明是一种用于产生和选择与特异性配体(例如抗原)结合的新型蛋白质的强大工具。使用噬菌体展示技术可以产生大型蛋白质变体文库，并且可以快速分类以高亲和力与靶抗原结合的序列。编码变体多肽的核酸与编码病毒包膜蛋白(例如，基因iii蛋白或基因viii蛋白)的核酸序列融合。已经开发出单价噬菌体展示系统，其中将编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因iii蛋白的一部分的核酸序列融合。在单价噬
菌体展示系统中，融合基因以低水平表达并且还表达野生型基因iii蛋白，因此维持颗粒感染性。
[0078]
证明肽在丝状噬菌体的表面上的表达和功能性抗体片段在大肠杆菌的外周胞质中的表达在开发抗体噬菌体展示文库中是重要的。已经以多种方式制备抗体或抗原结合多肽的文库，例如通过经由插入随机dna序列改变单基因的方法或通过克隆相关的基因序列的方法。可以针对具有所需特征的抗体或抗原结合蛋白的表达对文库进行筛选。
[0079]
所述噬菌体展示技术对于产生具有所需特征的抗体具有优于典型杂交瘤和重组方法的若干个优点。该技术允许在不使用动物的情况下在短时间内产生具有各种序列的大型抗体文库。杂交瘤或人源化抗体的产生可能需要几个月的产生时间段。此外，由于不需要免疫，因此噬菌体抗体文库可以产生针对有毒或低抗原性的抗原的抗体。所述噬菌体抗体文库可以用于产生和鉴定新型治疗性抗体。
[0080]
可以应用从经免疫或未经免疫的人、种系序列或使用噬菌体展示文库的初始b细胞ig库产生人抗体的技术。多种淋巴组织可以用于制备未致敏或非免疫原性抗原结合文库。
[0081]
能够从噬菌体展示文库鉴定和分离高亲和力抗体的技术对于分离新型治疗性抗体是重要的。从所述文库分离高亲和力抗体可以取决于文库的大小、细菌细胞中的产生效率和文库的多样性。所述文库的大小会因抗体或抗原结合蛋白的不当折叠和由于存在终止密码子所致的无效产生而降低。当所述抗体或抗原结合结构域未正确折叠时，可能抑制细菌细胞中的表达。可以通过使可变/恒定界面的表面上的残基或所选择的cdr残基交替突变来改善表达。框架区的序列是用于在细菌细胞中产生抗体噬菌体文库时提供适当折叠的元件。
[0082]
对于高亲和力抗体的分离，重要的是产生抗体或抗原结合蛋白的不同文库。cdr3区已经经常被发现参与抗原结合。由于重链上的cdr3区在大小、序列和结构构象方面相当地不同，因此可以使用其制备各种文库。
[0083]
此外，可以通过在每个位置使用全部20个氨基酸来随机化可变重链和轻链的cdr，从而产生多样性。全部20个氨基酸的使用可以导致高度多样化的变体抗体序列，并且可以增加鉴定新型抗体的机会。
[0084]
本发明的抗体或抗体片段可以不仅包括本发明的抗pd
‑
l1抗体的序列，而且还包括在实现pd
‑
l1的特异性识别的范围内的其生物等同物。例如，可以对抗体的氨基酸序列做出另外的修饰以进一步改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。氨基酸变异是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，疏水性、亲水性、电荷、大小等。基于对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型进行分析，所有精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电的残基，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似大小，并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸可以被视为生物学功能等同物，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸可以被视为生物学功能等同物，并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可以被视为生物学功能等同物。
[0085]
考虑到具有等效的生物活性的上述变异，本发明的抗体或编码其的核酸分子理解为包括与序列编号所示的序列具有基本同一性的序列。当将本发明的序列和任何其他序列进行比对以便彼此尽可能多地对应并使用本领域中通常使用的算法进行分析时，所述基本
同一性是指展现出至少90％同源性，优选至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性或至少99％同源性的序列。用于序列比较的比对方法是本领域中已知的。ncbi基本局部比对搜索工具(blast)是通过nbci等可使用的，并且可以与测序程序(如互联网上的blastp、blastm、blastx、tblastn和tblastx)结合使用。blast可在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/获得。用于使用该程序比较序列同源性的方法可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast_help.html上找到。
[0086]
基于此，本发明的抗体或其抗原结合片段可以与指定序列或本说明书中所述的全部序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性。这种同源性可以通过使用本领域中已知的方法进行序列比较和/或比对来确定。例如，本发明的核酸或蛋白质的序列同源性百分比可以使用序列比较算法(即blast或blast 2.0)、手动比对或目视检查来确定。
[0087]
在另一方面，本发明涉及一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
[0088]
抗体或其抗原结合片段可以通过分离编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸来重组产生。所述核酸被分离并插入可复制的载体中以用于进一步克隆(dna扩增)或进一步表达。在另一方面，基于此，本发明涉及一种包含所述核酸的载体。
[0089]
如本文所用，术语“核酸”具有全面涵盖dna(gdna和cdna)和rna分子以及作为核酸的基本构建块的核苷酸的含义，所述核苷酸包括天然核苷酸以及其中糖或碱基区域经修饰的类似物。编码本发明的重链可变区和轻链可变区的核酸的序列可以是修饰的。这种修饰包括核苷酸的添加、缺失或非保守或保守取代。
[0090]
编码所述抗体的dna可使用典型程序(例如使用能够与编码所述抗体的重链和轻链的dna特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离或合成。许多载体是可商购的。载体组分通常包括但不限于选自信号序列、复制起点、至少一种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列中的至少一种。
[0091]
如本文所用，术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的手段，包括质粒载体、粘粒载体、病毒载体(如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体)等。在载体中，编码所述抗体的核酸与启动子可操作地连接。
[0092]
如本文所用，术语“可操作地连接”意指核酸表达控制序列(例如启动子、信号序列或转录调节物结合位点的阵列)与不同核酸序列之间的功能性连接，由此控制序列用于控制不同核酸序列的转录和/或翻译。
[0093]
当使用原核细胞作为宿主时，通常包括能够传播转录的强启动子(例如tac启动子、lac启动子、lacuv5启动子、lpp启动子、plλ启动子、prλ启动子、rac5启动子、amp启动子、reca启动子、sp6启动子、trp启动子或t7启动子)、用于启动翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。另外，例如，当真核细胞用作宿主时，可以使用源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子、β
‑
肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子或人肌肉肌酸启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、hsv的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、hiv的ltr启动子、莫洛尼病毒的启动子、eb病毒(ebv)的启动子或劳斯肉瘤病毒(rsv)的启动子)，并且通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
[0094]
在一些情况下，所述载体可以与另一序列融合以促进由其表达的抗体的纯化。融
合的序列的例子包括谷胱甘肽s
‑
转移酶(pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(neb，美国)、flag(ibi，美国)和6x his(六组氨酸；qiagen，美国)。
[0095]
所述载体含有作为选择标记物的本领域常用的抗生素抗性基因，例如赋予对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素或四环素的抗性的基因。
[0096]
在另一方面，本发明涉及一种用上述载体转染的细胞。用于产生本发明的抗体的细胞的例子可以包括但不限于原核细胞、酵母细胞和高等真核细胞。
[0097]
可以使用属于芽孢杆菌属(bacillus)的菌株(如大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis))以及原核宿主细胞(如链霉菌属(streptomyces)、假单胞菌属(pseudomonas)(例如恶臭假单胞菌(pseudomonas putida))、奇异变形杆菌(proteus mirabilis)和葡萄球菌属(staphylococcus)(例如肉葡萄球菌(staphylococcus carnosus))。
[0098]
在此，动物细胞是最受关注的，并且有用的宿主细胞系的例子可以包括但不限于cos
‑
7、bhk、cho、cho
‑
s、chok1、gs
‑
cho、dxb
‑
11、dg
‑
44、cho/
‑
dhfr、cv1、hek293、tm4、vero、hela、mdck、brl 3a、w138、hep g2、sk
‑
hep、mmt、tri、mrc 5、fs4、3t3、rin、a549、pc12、k562、per.c6、sp2/0、ns
‑
0、u2os和ht1080。
[0099]
在仍又另一方面，本发明涉及一种产生所述抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括(a)培养上述细胞和(b)从培养的细胞纯化抗体或其抗原结合片段。
[0100]
可以在各种培养基中培养所述细胞。可以无限制地使用任何可商购的培养基作为培养基。可以以适当的浓度包含本领域技术人员已知的所有其他必需补充剂。培养条件(如温度、ph等)是已经用于选择用于表达的宿主细胞的那些，这对于本领域技术人员来说是清楚的。
[0101]
对于所述抗体或其抗原结合片段的纯化，可以通过例如离心或超滤去除杂质，并且可以使用例如亲和色谱纯化所得产物。可以使用其他另外的纯化技术，如阴离子或阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱等。
[0102]
在其他方面，本发明涉及一种用于预防或治疗癌症的包含上述抗体作为活性成分的组合物。
[0103]
本发明可以提出例如一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含(a)药学有效量的根据本发明的针对pd
‑
l1的抗体或其抗原结合片段和(b)药学上可接受的载体。另外，本发明涉及一种预防或治疗癌症的方法，所述方法包括以患者所需的有效量施用根据本发明的针对pd
‑
l1的抗体或其抗原结合片段。
[0104]
由于所述组合物使用上述根据本发明的抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段作为活性成分，因此省略了它们之间共同内容的描述。
[0105]
pd
‑
l1与pd
‑
1的结合负调节t细胞抗原特异性应答，这对于耐受和预防自身免疫和免疫病理学是重要的。然而，过度的pd
‑
l1/pd
‑
1相互作用(可能由慢性抗原刺激诱导)可能导致t细胞抗原特异性应答的抑制和t细胞的损失，这是t细胞衰竭的特征。t细胞衰竭是一种t细胞功能障碍的状态，其可能发生在慢性感染和癌症中。它通过效应功能差、抑制性受体的持续表达和不同于功能性效应或记忆t细胞的转录状态来定义。衰竭干扰对感染和肿瘤进展的控制。
[0106]
如后面结合例子所证明的，根据本发明的抗体或其抗原结合片段以高亲和力与pd
‑
l1结合，从而抑制pd
‑
1/pd
‑
l1复合物的形成，由此可以有效地用于治疗诱导t细胞衰竭从而逃避抗肿瘤t细胞活性的癌症。
[0107]
本发明还涉及一种用于通过将根据本发明的抗体或其抗原结合片段与另一种抗癌剂组合施用来预防或治疗癌症的组合疗法的组合物。
[0108]
本发明可以提出例如一种用于预防或治疗癌症的组合疗法的组合物，所述组合物包含(a)药学有效量的根据本发明的针对pd
‑
l1的抗体或其抗原结合片段和(b)药学上可接受的载体。本发明还涉及一种用于预防或治疗癌症的组合疗法，所述组合疗法包括以患者所需的有效量施用根据本发明的针对pd
‑
l1的抗体或其抗原结合片段。
[0109]
由于所述组合物使用上述根据本发明的抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段作为活性成分，因此省略了它们之间共同内容的描述。
[0110]
如上所述，根据本发明的抗体与另一种抗癌剂组合使用，从而可以有效靶向过表达pd
‑
l1的肿瘤细胞并增加抗肿瘤t细胞活性，由此增强靶向所述肿瘤细胞的免疫应答。
[0111]
可以使用其他抗肿瘤剂或免疫原性剂[(例如减毒的癌细胞、肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、抗原呈递细胞(例如用肿瘤衍生抗原或核酸脉冲的树突细胞)、免疫刺激细胞因子(例如il
‑
2、ifnα2、gm
‑
csf)以及用编码免疫刺激细胞因子(其包括但不限于例如gm
‑
csf)的基因转染的细胞]、含有靶向癌症抗原的抗体的细胞(例如car
‑
t、car
‑
nk)、肿瘤微环境的免疫抑制性抑制剂(例如ido抑制剂)、溶瘤病毒、标准癌症疗法(例如化学疗法、放射疗法或手术)或其他癌症相关抗原。
[0112]
此外，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可以与另一种抗体一起使用(除pd
‑
l1抗体之外的抗体的例子可以包括但不限于针对vegf、egfr、her2/neu、vegf受体、其他生长因子受体、cd20、cd40、ctla
‑
4、ox
‑
40、4
‑
1bb和icos的抗体)。
[0113]
具体地，可以不受限制地使用可与根据本发明的抗体或其抗原结合片段一起使用的抗体，只要它是能够特异性结合至与癌症或自身免疫疾病相关的抗原的抗体即可，并且这种抗原的例子可以包括但不限于4
‑
1bb、整联蛋白、血管生成素、血管生成素类似物3、b细胞激活因子(baff)、b7
‑
h3、ccr4、cd3、cd4、cd6、cd11a、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd40、cd52、cd62、cd79b、cd80、cgrp、ox
‑
40、icos、密封蛋白
‑
18、ctla4、dll3、egf受体、fc受体、fgf23、叶酸受体、gd2、gm
‑
csf、her2、her2/neu、her3、vegf、vegf受体、干扰素受体、干扰素γ、ige、igf
‑
1受体、白介素1、白介素2受体、白介素4受体、白介素5、白介素5受体、白介素6、白介素6受体、白介素7、白介素12/23、白介素13、白介素17a、白介素17受体a、白介素31受体、白介素36受体、lag3、lfa3、ngf、pvsk9、pd
‑
1、pd
‑
l1、rank
‑
l、slamf7和组织因子。
[0114]
更具体地，与上述抗原结合的抗体的例子包括：
[0115]
针对4
‑
1bb的抗体，如乌托鲁单抗；
[0116]
针对整联蛋白的抗体，如那他珠单抗、依卓利珠单抗、维多珠单抗和比玛卢单抗；
[0117]
针对β淀粉样蛋白的抗体，如巴匹珠单抗、克瑞组单抗、索拉珠单抗、阿杜卡奴单抗和更汀芦单抗；
[0118]
针对血管生成素的抗体，如amg 780；
[0119]
针对血管生成素类似物3的抗体，如依维苏单抗；
[0120]
针对b细胞激活因子(baff)的抗体，如他贝芦单抗、伊利尤单抗和贝利单抗；
[0121]
针对b7
‑
h3的抗体，如奥伯塔单抗(omburtamab)；
[0122]
针对ccr4的抗体，如莫格利珠单抗；
[0123]
针对cd3的抗体，如奥昔组单抗、替利组单抗、莫罗单抗、替本福司(它是一种针对gp100和cd3的双特异性抗体)、博纳吐单抗(它是一种针对cd19和cd3的双特异性抗体)以及regn1979(它是一种针对cd20和cd3的双特异性抗体)；
[0124]
针对cd4的抗体，如伊巴组单抗和扎木单抗；
[0125]
针对cd6的抗体，如伊利组单抗；
[0126]
针对cd11a的抗体，如依法利珠单抗；
[0127]
针对cd19的抗体，如英比利珠单抗、他法西他单抗和作为adc的替朗妥昔单抗；
[0128]
针对cd20的抗体，如奥瑞组单抗、乌妥昔单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥法木单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗和作为adc的替伊莫单抗；
[0129]
针对cd22的抗体，如依帕珠单抗以及作为adc的奥英妥珠单抗和鲁磨西替(moxetumomab pasudotox)；
[0130]
针对cd30的adc，如维汀
‑
本妥昔单抗；
[0131]
针对cd33的adc，如他立林
‑
伐达妥昔单抗和奥佐米星
‑
吉妥珠单抗；
[0132]
针对cd38的抗体，如达雷木单抗和艾萨妥昔单抗；
[0133]
针对cd52的抗体，如阿仑单抗；
[0134]
针对cd62的抗体，如立赞利珠单抗；
[0135]
针对cd79b的adc，如维汀
‑
泊洛妥珠单抗；
[0136]
针对cd80的抗体，如加利昔单抗；
[0137]
针对cgrp的抗体，如依普奈珠单抗、瑞玛奈珠单抗、伽奈珠单抗和厄瑞努单抗；
[0138]
针对密封蛋白
‑
18的抗体，如佐妥昔单抗；
[0139]
针对ctla4的抗体，如曲美木单抗、泽弗利单抗和伊匹单抗；
[0140]
针对dll3的adc，如特司林
‑
洛伐妥珠单抗；
[0141]
针对egf受体的抗体，如西妥昔单抗、迪妥昔珠单抗、扎芦木单抗、耐昔妥珠单抗和帕尼单抗；
[0142]
针对fc受体的抗体，如尼卡利单抗(nipocalimab)和洛利昔珠单抗；
[0143]
针对fgf23的抗体，如布罗舒单抗；
[0144]
针对叶酸受体的抗体，如法乐妥珠单抗和作为adc的索星
‑
米妥昔单抗；
[0145]
针对gd2的抗体，如地努图希单抗和那昔妥单抗；
[0146]
针对gm
‑
csf的抗体，如奥蒂利单抗(otilimab)；
[0147]
针对her2的抗体，如玛格妥昔单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗以及作为adc的德卢替康
‑
曲妥珠单抗、美坦新
‑
曲妥珠单抗和多
‑
曲妥珠单抗；
[0148]
针对her3的抗体，如帕曲妥单抗；
[0149]
针对干扰素受体的抗体，如阿尼鲁单抗；
[0150]
针对干扰素γ的抗体，如依玛鲁单抗；
[0151]
针对ige的抗体，如利格利珠单抗和奥马珠单抗；
[0152]
针对igf
‑
1受体的抗体，如达罗托组单抗、芬妥木单抗和替妥木单抗；
[0153]
针对白介素1的抗体，如吉伏组单抗和卡那单抗；
[0154]
针对白介素2受体的抗体，如达利珠单抗和巴利昔单抗；
[0155]
针对白介素4受体的抗体，如度匹鲁单抗；
[0156]
针对白介素5的抗体，如美泊利单抗和瑞利珠单抗；
[0157]
针对白介素5受体的抗体，如贝那利珠单抗；
[0158]
针对白介素6的抗体，如克拉扎珠单抗、奥洛吉珠单抗、西鲁库单抗和司妥昔单抗；
[0159]
针对白介素6受体的抗体，如萨瑞鲁单抗、沙利珠单抗、托珠单抗和regn88；
[0160]
针对白介素7的抗体，如苏金单抗；
[0161]
针对白介素12/23的抗体，如优特克单抗和布雷奴单抗；
[0162]
针对白介素13的抗体，如来瑞组单抗和曲罗芦单抗；
[0163]
针对白介素17a的抗体，如依奇珠单抗和比美吉珠单抗；
[0164]
针对白介素17受体a的抗体，如布罗达单抗；
[0165]
针对白介素23的抗体，如布雷库单抗、古塞库单抗、瑞莎珠单抗、替曲吉珠单抗和米吉珠单抗；
[0166]
针对白介素31受体的抗体，如奈莫利珠单抗；
[0167]
针对白介素36受体的抗体，如斯佩索利单抗(spesolimab)；
[0168]
针对lag3的抗体，如瑞拉利单抗；
[0169]
针对nasp2的抗体，如纳索利单抗；
[0170]
针对ngf的抗体，如法司努单抗和他奈珠单抗；
[0171]
针对pvsk9的抗体，如阿利库单抗、依伏库单抗和伯考赛珠单抗；
[0172]
针对pd
‑
1的抗体，如帕博利珠单抗、巴替利单抗、卡瑞利珠单抗、西米普利单抗、多塔利单抗、普罗戈利单抗(prolgolimab)、信迪利单抗、司利珠单抗、替雷利珠单抗、派姆单抗和纳武单抗；
[0173]
针对pd
‑
l1的抗体，如阿特珠单抗、阿维鲁单抗、恩弗利单抗、度伐单抗和必特芙普α(它是一种针对tgf
‑
β和pd
‑
l1的双特异性抗体)；
[0174]
针对rank
‑
l的抗体，如地诺单抗；
[0175]
针对slamf7的抗体，如艾洛珠单抗；
[0176]
针对组织因子的抗体，如康赛珠单抗和马塔西单抗；
[0177]
针对tnf、特别是tnfα的抗体，如英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、聚乙二醇
‑
赛妥珠单抗(它是一种抗体片段)和奥利组单抗(一种针对tnf和白蛋白的双特异性抗体)；
[0178]
针对vegf的抗体，如布洛赛珠单抗、兰尼单抗、贝伐单抗和法瑞西单抗(它是针对vegf和ang2的双特异性抗体)；以及
[0179]
针对vegf受体的抗体，如雷莫芦单抗，
[0180]
但不限于此。
[0181]
癌症是一种可应用所述组合物的疾病，其通常包括对免疫疗法有反应的癌症和迄今为止尚未涉及免疫疗法的癌症。待治疗的癌症的非限制性例子可以包括黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食管癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其他肿瘤。另
外，本发明涵盖使用本发明的抗体可以抑制其生长的难治性或复发性癌症。
[0182]
根据本发明的抗体或抗体片段也可以单独使用或与疫苗组合使用以刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。所述抗体或其抗原结合片段可以用于刺激对感染人类的病毒的免疫应答，所述病毒包括但不限于例如人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、eb病毒、人巨细胞病毒、人乳头瘤病毒和疱疹病毒。所述抗体或其抗原结合片段可以用于刺激对细菌或真菌寄生虫感染和其他病原体感染的免疫应答。
[0183]
本发明还涉及一种包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段和有用细菌的组合物。所述有用细菌用作具有抗癌功效的细菌或益生菌，并且其例子可以包括但不限于厌氧球菌属(anaerococcus)、厌氧棒杆菌属(anaerostipes)、另枝菌属(alistipes)、阿克曼氏菌属(akkermansia)、芽孢杆菌属(bacillus)、拟杆菌属(bacteroides)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、布劳特氏菌属(blautia)、碳酸噬胞菌属(capnocytophaga)、梭菌属(clostridium)、柯林斯氏菌属(collinsella)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)、多尔氏菌属(dorea)、肠球菌属(enterococcus)、埃希氏杆菌属(escherichia)、真杆菌属(eubacterium)、粪杆菌属(faecalibacterium)、梭杆菌属(fusobacterium)、加德纳菌属(gardnerella)、芽殖菌属(gemmiger)、克雷伯菌属(klebsiella)、乳杆菌属(lactobacillus)、明串珠菌属(leuconostoc)、莫氏杆菌(moryella)、副普雷沃菌属(paraprevotella)、副杆拟菌属(parabacteroides)、考拉杆菌属(phascolarctobacterium)、卟啉单胞菌属(porphyromonas)、普雷沃菌属(prevotella)、假丁酸弧菌属(pseudobutyrivibrio)、罗斯氏菌(roseburia)、罗氏菌属(rothia)、瘤胃球菌属(ruminococcus)、志贺氏菌属(shigella)、链球菌属(shigella)、链球菌属(streptococcus)、韦荣球菌属(veillonella)、魏斯氏菌属(weissella)等。
[0184]
本发明组合物中含有的药学上可接受的载体可以包括配制品中常用的那些，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。除了上述组分之外，本发明的组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。
[0185]
本发明的药物组合物可以口服或肠胃外施用，并且肠胃外施用的例子可以包括静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠内施用等。
[0186]
当口服施用时，所述蛋白质或肽是可消化的，因此必须配制口服组合物使得活性剂被包被或被保护免于在胃中降解。此外，可以使用能够将所述活性剂转运至靶细胞的任何装置来施用所述药物组合物。
[0187]
根据本发明的组合物的适当剂量可以根据多种因素而变化，所述因素如配制方法、施用方式、患者的年龄、体重和性别、发病率、食物、施用时间、施用途径、排泄率和反应敏感性，并且对所需治疗或预防而言有效的剂量可以由普通熟练的医生容易地确定和开出。例如，本发明的药物组合物的日剂量是0.0001
‑
100mg/kg。如本文所用，术语“药学有效量”是指足以预防或治疗癌症的量。
[0188]
本发明的药物组合物可以配制成单位剂型或可以使用药学上可接受的载体和/或赋形剂根据本发明所属领域的普通技术人员容易实施的方法制备在多剂量容器中。在此，
所述配制品可以采取在油性或水性介质中的溶液、悬浮液或乳液的形式，或者可以采取提取物、粉末(拉丁语粉剂)、栓剂、颗粒、片剂或胶囊的形式，并且还可以包含分散剂或稳定剂。
[0189]
本发明的组合物可以作为治疗剂单独施用，或者可以与另一种治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂依序或同时施用。
[0190]
在仍另一方面，本发明提供了一种抗体
‑
药物缀合物，其中药物与根据本发明的抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段缀合；以及一种包含其的药物组合物。另外，本发明提供了一种使用所述抗体
‑
药物缀合物和包含其的药物组合物治疗肿瘤的方法，其中所述药物与所述抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段缀合。
[0191]
所述抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段可以经由接头与药物结合。所述接头是将所述抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段与所述药物连接的位点。例如，所述接头在细胞内条件下是可切割的，并且具体地，所述药物可以通过在细胞内环境中切割接头而从抗体释放。
[0192]
所述接头可以被细胞内环境中存在的切割剂(例如溶酶体或内体)切割，并且可以是例如可被细胞内肽酶或蛋白酶(如溶酶体或内体蛋白酶)切割的肽接头。典型地，肽接头具有至少两个氨基酸的长度。所述切割剂可以包括组织蛋白酶b、组织蛋白酶d和纤溶酶，并且能够水解肽以将药物释放到靶细胞中。
[0193]
所述肽接头可以被在癌组织中过表达的硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶
‑
b切割，并且例如可以使用phe
‑
leu或gly
‑
phe
‑
leu
‑
gly接头。此外，所述肽接头可以被例如细胞内蛋白酶切割，并且可以是val
‑
cit接头或phe
‑
lys接头。
[0194]
在一个实施方案中，所述可切割的接头是ph敏感的，并且可能在某一ph值下对水解敏感。通常，ph敏感的接头可以在酸性条件下水解。能够在溶酶体中水解的酸不稳定接头的例子可以包括腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等。
[0195]
在另一个实施方案中，所述接头可以在还原条件下被切割，并且可以包括例如二硫键接头。可以使用sata(n
‑
琥珀酰亚胺基
‑
s
‑
乙酰硫代乙酸酯)、spdp(n
‑
琥珀酰亚胺基
‑3‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丙酸酯)、spdb(n
‑
琥珀酰亚胺基
‑3‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丁酸酯)和smpt(n
‑
琥珀酰亚胺基
‑
氧羰基
‑
α
‑
甲基
‑
α
‑
(2
‑
吡啶基
‑
二硫代)甲苯)形成各种二硫键。
[0196]
所述药物和/或所述药物接头可以经由所述抗体的赖氨酸或经由在二硫键链还原时暴露的半胱氨酸随机缀合。在一些情况下，接头
‑
药物可以经由基因工程化标记(例如存在于肽或蛋白质中的半胱氨酸)结合。所述基因工程化标记(例如肽或蛋白质)可以包括可被例如类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序。所述肽或蛋白质可以在肽或蛋白质的羧基末端具有缺失，或者可以通过间隔子单元的共价键在肽或蛋白质的羧基(c)末端具有添加。
[0197]
此外，所述接头可以是例如不可切割的接头，并且所述药物可以仅通过抗体水解的单个步骤释放从而产生例如氨基酸/接头/药物复合物。这种类型的接头可以是硫醚基团或马来酰亚胺基己酰基基团，并且可以在血液中保持稳定。
[0198]
所述抗体
‑
药物缀合物中的药物可以是展现出药理作用的药剂，并且可以与抗体结合，并且其具体例子可以包括化疗剂、毒素、微小rna(mirna)、sirna、shrna和放射性同位素。所述化学治疗剂可以例如是细胞毒性剂或免疫抑制剂。具体地，它可以包括微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或能够充当dna嵌入剂的化学治疗剂。它还可以包括免疫调节化合物、抗癌剂、抗病毒剂或其组合。
[0199]
这种药物可以是选自以下的至少一种：例如，美登木素生物碱(maytansinoid)、阿里他汀、氨基蝶呤、放线菌素、博来霉素、他利霉素、喜树碱、n8
‑
乙酰基亚精胺、1
‑
(2
‑
氯乙基)
‑
1,2
‑
二甲基磺酰肼、埃斯培拉霉素(esperamicin)、依托泊苷、6
‑
巯基嘌呤、尾海兔素、单端孢菌素、卡奇霉素、紫杉醇(taxol)、紫杉烷、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛、甲氨蝶呤、长春新碱、长春碱、多柔比星、美法仑、丝裂霉素a、丝裂霉素c、苯丁酸氮芥、杜卡霉素、l
‑
天冬酰胺酶、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲、顺铂、卡铂、丝裂霉素、达卡巴嗪、丙卡巴肼、拓扑替康、氮芥、环磷酰胺、5
‑
氟尿嘧啶、cnu(二氯乙基亚硝基脲)、伊立替康、伊达比星、道诺霉素、更生霉素、普卡霉素、米托蒽醌、天冬酰胺酶、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀、洛莫司汀、白消安、苏消安、达卡巴嗪、替尼泊苷、拓扑替康、9
‑
氨基喜树碱、克雷斯托、三甲曲沙、霉酚酸、噻唑呋林、利巴韦林、eicar(5
‑
乙炔基
‑1‑
β
‑
d核糖呋喃糖基咪唑
‑4‑
甲酰胺)、羟基脲、去铁胺、氟尿苷、多西氟尿啶、雷替曲塞、阿糖胞苷(ara c)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟达拉滨、他莫昔芬、雷洛昔芬、甲地孕酮、戈舍瑞林、乙酸亮丙瑞林、氟他胺、比卡鲁胺、eb1089、cb1093、kh1060、维替泊芬、酞菁、光敏剂pe4、脱甲氧基竹红菌素a、干扰素
‑
α、干扰素
‑
γ、肿瘤坏死因子、吉西他滨、万珂(velcade)、来那度胺、沙利度胺、洛伐他汀、1
‑
甲基
‑4‑
苯基吡啶鎓、星形孢菌素、放线菌素d、更生霉素、博来霉素a2、博来霉素b2、培洛霉素、表柔比星、吡柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、维拉帕米、毒胡萝卜素、核酸酶和源自细菌或动物和植物的毒素，但不限于此。
[0200]
在又另一方面，本发明提供了一种双特异性抗体，其中根据本发明的抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段与结合至另一抗原的抗体结合。
[0201]
可以不受限制地使用与根据本发明的抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段一起形成所述双特异性抗体的抗体，只要它是能够特异性地结合至与癌症或自身免疫疾病相关的抗原的抗体即可。这种抗原的例子可以包括但不限于4
‑
1bb、整联蛋白、血管生成素、血管生成素类似物3、b细胞激活因子(baff)、b7
‑
h3、ccr4、cd3、cd4、cd6、cd11a、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd40、cd52、cd62、cd79b、cd80、cgrp、ox
‑
40、icos、密封蛋白
‑
18、ctla4、dll3、egf受体、fc受体、fgf23、叶酸受体、gd2、gm
‑
csf、her2、her2/neu、her3、vegf、vegf受体、干扰素受体、干扰素γ、ige、igf
‑
1受体、白介素1、白介素2受体、白介素4受体、白介素5、白介素5受体、白介素6、白介素6受体、白介素7、白介素12/23、白介素13、白介素17a、白介素17受体a、白介素31受体、白介素36受体、lag3、lfa3、ngf、pvsk9、pd
‑
1、pd
‑
l1、rank
‑
l、slamf7、组织因子、tgf
‑
β等。
[0202]
更具体地，与上述抗原结合的抗体的例子包括：
[0203]
针对4
‑
1bb的抗体，如乌托鲁单抗；
[0204]
针对整联蛋白的抗体，如那他珠单抗、依卓利珠单抗、维多珠单抗和比玛卢单抗；
[0205]
针对β淀粉样蛋白的抗体，如巴匹珠单抗、克瑞组单抗、索拉珠单抗、阿杜卡奴单抗和更汀芦单抗；
[0206]
针对血管生成素的抗体，如amg 780；
[0207]
针对血管生成素类似物3的抗体，如依维苏单抗；
[0208]
针对b细胞激活因子(baff)的抗体，如他贝芦单抗、伊利尤单抗和贝利单抗；
[0209]
针对b7
‑
h3的抗体，如奥伯塔单抗；
[0210]
针对ccr4的抗体，如莫格利珠单抗；
[0211]
针对cd3的抗体，如奥昔组单抗、替利组单抗、莫罗单抗、替本福司(它是一种针对gp100和cd3的双特异性抗体)、博纳吐单抗(它是一种针对cd19和cd3的双特异性抗体)以及regn1979(它是一种针对cd20和cd3的双特异性抗体)；
[0212]
针对cd4的抗体，如伊巴组单抗和扎木单抗；
[0213]
针对cd6的抗体，如伊利组单抗；
[0214]
针对cd11a的抗体，如依法利珠单抗；
[0215]
针对cd19的抗体，如英比利珠单抗、他法西他单抗和作为adc的替朗妥昔单抗；
[0216]
针对cd20的抗体，如奥瑞组单抗、乌妥昔单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥法木单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗和作为adc的替伊莫单抗；
[0217]
针对cd22的抗体，如依帕珠单抗以及作为adc的奥英妥珠单抗和鲁磨西替；
[0218]
针对cd30的adc，如维汀
‑
本妥昔单抗；
[0219]
针对cd33的adc，如他立林
‑
伐达妥昔单抗和奥佐米星
‑
吉妥珠单抗；
[0220]
针对cd38的抗体，如达雷木单抗和艾萨妥昔单抗；
[0221]
针对cd52的抗体，如阿仑单抗；
[0222]
针对cd62的抗体，如立赞利珠单抗；
[0223]
针对cd79b的adc，如维汀
‑
泊洛妥珠单抗；
[0224]
针对cd80的抗体，如加利昔单抗；
[0225]
针对cgrp的抗体，如依普奈珠单抗、瑞玛奈珠单抗、伽奈珠单抗和厄瑞努单抗；
[0226]
针对密封蛋白
‑
18的抗体，如佐妥昔单抗；
[0227]
针对ctla4的抗体，如曲美木单抗、泽弗利单抗和伊匹单抗；
[0228]
针对dll3的adc，如特司林
‑
洛伐妥珠单抗；
[0229]
针对egf受体的抗体，如西妥昔单抗、迪妥昔珠单抗、扎芦木单抗、耐昔妥珠单抗和帕尼单抗；
[0230]
针对fc受体的抗体，如尼卡利单抗和洛利昔珠单抗；
[0231]
针对fgf23的抗体，如布罗舒单抗；
[0232]
针对叶酸受体的抗体，如法乐妥珠单抗和作为adc的索星
‑
米妥昔单抗；
[0233]
针对gd2的抗体，如地努图希单抗和那昔妥单抗；
[0234]
针对gm
‑
csf的抗体，如奥蒂利单抗；
[0235]
针对her2的抗体，如玛格妥昔单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗以及作为adc的德卢替康
‑
曲妥珠单抗、美坦新
‑
曲妥珠单抗和多
‑
曲妥珠单抗；
[0236]
针对her3的抗体，如帕曲妥单抗；
[0237]
针对干扰素受体的抗体，如阿尼鲁单抗；
[0238]
针对干扰素γ的抗体，如依玛鲁单抗；
[0239]
针对ige的抗体，如利格利珠单抗和奥马珠单抗；
[0240]
针对igf
‑
1受体的抗体，如达罗托组单抗、芬妥木单抗和替妥木单抗；
[0241]
针对白介素1的抗体，如吉伏组单抗和卡那单抗；
[0242]
针对白介素2受体的抗体，如达利珠单抗和巴利昔单抗；
[0243]
针对白介素4受体的抗体，如度匹鲁单抗；
[0244]
针对白介素5的抗体，如美泊利单抗和瑞利珠单抗；
[0245]
针对白介素5受体的抗体，如贝那利珠单抗；
[0246]
针对白介素6的抗体，如克拉扎珠单抗、奥洛吉珠单抗、西鲁库单抗和司妥昔单抗；
[0247]
针对白介素6受体的抗体，如萨瑞鲁单抗、沙利珠单抗、托珠单抗和regn88；
[0248]
针对白介素7的抗体，如苏金单抗；
[0249]
针对白介素12/23的抗体，如优特克单抗和布雷奴单抗；
[0250]
针对白介素13的抗体，如来瑞组单抗和曲罗芦单抗；
[0251]
针对白介素17a的抗体，如依奇珠单抗和比美吉珠单抗；
[0252]
针对白介素17受体a的抗体，如布罗达单抗；
[0253]
针对白介素23的抗体，如布雷库单抗、古塞库单抗、瑞莎珠单抗、替曲吉珠单抗和米吉珠单抗；
[0254]
针对白介素31受体的抗体，如奈莫利珠单抗；
[0255]
针对白介素36受体的抗体，如斯佩索利单抗；
[0256]
针对lag3的抗体，如瑞拉利单抗；
[0257]
针对nasp2的抗体，如纳索利单抗；
[0258]
针对ngf的抗体，如法司努单抗和他奈珠单抗；
[0259]
针对pvsk9的抗体，如阿利库单抗、依伏库单抗和伯考赛珠单抗；
[0260]
针对pd
‑
1的抗体，如帕博利珠单抗、巴替利单抗、卡瑞利珠单抗、西米普利单抗、多塔利单抗、普罗戈利单抗、信迪利单抗、司利珠单抗、替雷利珠单抗、派姆单抗和纳武单抗；
[0261]
针对pd
‑
l1的抗体，如阿特珠单抗、阿维鲁单抗、恩弗利单抗和度伐单抗；
[0262]
针对rank
‑
l的抗体，如地诺单抗；
[0263]
针对slamf7的抗体，如艾洛珠单抗；
[0264]
针对组织因子的抗体，如康赛珠单抗和马塔西单抗；
[0265]
针对tnf、特别是tnfα的抗体，如英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、聚乙二醇
‑
赛妥珠单抗(它是一种抗体片段)和奥利组单抗(一种针对tnf和白蛋白的双特异性抗体)；
[0266]
针对vegf的抗体，如布洛赛珠单抗、兰尼单抗、贝伐单抗和法瑞西单抗(它是针对vegf和ang2的双特异性抗体)；以及
[0267]
针对vegf受体的抗体，如雷莫芦单抗，
[0268]
但不限于此。
[0269]
通过以下实施例可以更好地理解本发明。这些实施例仅用于说明本发明，且不应解释为限制本发明的范围，如对于本领域的普通技术人员而言清楚的。
[0270]
实施例
[0271]
实施例1.pd
‑
l1抗原表达与纯化
[0272]
使用含有pd
‑
l1 cdna基因的载体(sino biological)作为模板，将含有来自pd
‑
l1基因的n末端处信号序列的胞外区(met1
‑
thr239)的片段进行pcr扩增，并插入作为融合表达人fc片段的载体的pcep4
‑
fc载体的nhei和sfii限制酶切位点中，从而构建“pcep4
‑
pdl1
‑
fc”载体。
[0273]
之后，按照制造商提供的转染方法，使用细胞转染试剂fectopro(polyplus)将pd
‑
l1表达载体引入freestyle 293
‑
f细胞中，并进行培养约6至10天使得抗原蛋白从细胞中释
放出来。
[0274]
将释放到细胞培养基中的pd
‑
l1抗原蛋白使用蛋白a树脂(amicogen)通过开柱纯化方法纯化，用柠檬酸洗脱，然后用ph 9.4的1m tris溶液中和。将经中和的抗原蛋白通过用1x pbs缓冲液的5次透析过程进行纯化，并用于后续实验。
[0275]
实施例2.噬菌体文库的再扩增
[0276]
1)“噬菌体展示”技术用于选择与pd
‑
l1结合的人抗体。三种类型的人抗体文库用于通过噬菌体展示选择人抗体候选物，并且是1)“pnas,1999第96卷,第6953
‑
6958页”中报道的天然scfv文库、2)“molecules and cells,2009,第27卷,第225
‑
235页”中报道的合成的scfv文库以及3)由lg life sciences开发的“lg天然scfv文库”。
[0277]
2)对于噬菌体展示，从大肠杆菌再扩增噬菌体，从而产生展示scfv的噬菌体。该方法如下：文库“1)”使用论文中的“展示scfv的噬菌体的拯救”方法产生，文库“2)”根据论文中提到的“文库拯救”方法产生，并且文库“3)”通过单独的方法产生，并且其详细描述如下。
[0278]
3)将1小瓶含噬菌体的细胞解冻，接种至2l 2xyt(含1％葡萄糖、34μg/ml氯霉素和5mm mgcl2)中，在37℃下的振荡培养箱中培养至od600达到0.5，与moi值为20的vcsm13辅助噬菌体混合，并在没有摇动的情况下在37℃下的培养箱中培养45分钟，以使辅助噬菌体完全感染各个细胞。
[0279]
4)将感染的细胞转移至500ml sorvall管中，并以5000rpm离心15分钟，然后将细胞沉淀物重悬于2l的2xyt(含有1mm iptg、34μg/ml氯霉素、70μg/ml卡那霉素和5mm mgcl2)，然后在30℃下的振荡培养箱(220rpm)中培养过夜，从而产生噬菌体。
[0280]
5)在细胞培养过夜(220rpm，30℃)后，将细胞培养基在4℃且8000rpm下离心20分钟，丢弃细胞培养沉淀物，并且以相当于上清液体积的1/5的体积向上清液中添加peg/nacl(20％w/v peg 6000、0.25m nacl)溶液，并在冰上孵育约1小时，以使噬菌体聚集和沉降，接着在4℃下以8000rpm离心20分钟以提供噬菌体沉淀物。倒出上清液，将噬菌体沉淀物重悬于约80ml的pbs中以获得噬菌体溶液样品，并用0.45μm注射器过滤器去除噬菌体溶液样品中的杂质，从而完成噬菌体文库样品的制备。
[0281]
实施例3.噬菌体淘选
[0282]
1)根据制造商提供的实验方法，使用从dynal可获得的dynabeads
tm
m
‑
270epoxy珠将约10μg的pd
‑
l1抗原蛋白与12.5μl珠偶联，以制备与抗原蛋白偶联的磁珠，接着通过在室温下在含有3％bsa的pbs缓冲液中孵育1小时进行封闭反应。
[0283]
2)将在通过使用注射器过滤器的peg/nacl沉淀而纯化的噬菌体的表面上表达的约10
13
人抗体悬浮于含有1％bsa和0.05％tween的pbs溶液中，并置于用12.5μg/ml先前制备的人抗体(green cross，10％iv
‑
球蛋白sn注射液)样品包被的免疫管(nunc)中，接着进行减去反应以去除与fc区结合的噬菌体(室温下2小时)。
[0284]
3)减去完成后，将所得的噬菌体溶液与和抗原蛋白偶联的磁珠混合，在室温下搅拌约2小时，使得能够与抗原蛋白结合的抗体噬菌体与磁珠结合，然后置于磁化的macs柱(miltenyi biotech)中，以提供与和抗原蛋白偶联的磁珠结合的抗体。
[0285]
4)在淘选期间，调整严格度，使得在增加洗涤过程的次数的同时，可以选择许多高亲和力抗体，例如，第一次用6ml pbs洗涤一次，第二次和第三次用6ml pbs洗涤两次，第四次用7ml pbs洗涤三次，以此类推。
[0286]
5)在用pbs缓冲液洗涤后，将700μl 0.25％胰蛋白酶溶液注入macs柱中以用胰蛋白酶溶液填充柱，将柱在37℃下在培养箱中培养30分钟以诱导噬菌体洗脱，并且将柱以1,000rpm离心1分钟以获得洗脱的噬菌体，然后将其与培养至od600＝约0.7
‑
0.8的程度的新鲜制备的er2738(neb)大肠杆菌混合，以诱导大肠杆菌感染洗脱的噬菌体。
[0287]
6)将用噬菌体感染的大肠杆菌铺在包含相应抗生素的固体lb板(含1％葡萄糖)上，在30℃下在培养箱中培养过夜，使得大肠杆菌能够生长至细棉布。生长完成后，使用刮刀收获覆盖板的大肠杆菌，并通过实施例2中使用的方法再扩增噬菌体颗粒。
[0288]
实施例4.通过elisa和facs实验选择与pd
‑
l1抗原蛋白结合的抗体
[0289]
1)为了证实与pd
‑
l1抗原蛋白的结合，从表达单独抗体的约1,700个细菌菌株获得含有抗体片段的周质级分，并进行elisa和facs选择实验。
[0290]
2)为了从每个大肠杆菌菌株获得抗体片段蛋白，将单一菌落细菌接种到分配了约1ml的lb培养基的96深孔板中，在37℃在振荡培养箱中培养，然后当od600值达到约0.7
‑
0.8时添加1mm iptg，接着在30℃下摇动孵育过夜，以诱导抗体片段在大肠杆菌的周质中表达。
[0291]
3)第二天，为了提取周质组分，将培养的大肠杆菌离心(4,000rpm，15分钟，4℃)，倒出上清液，并将大肠杆菌完全重悬于80μl冰冷的1x tes缓冲液(20％w/v蔗糖，50mm tris，1mm edta，ph 8.0)中，在冰上静置30分钟，进一步添加120μl冰冷的0.2x tes缓冲液，混合，并使其静置另外约30分钟以使用渗透压诱导周质组分的提取。之后，通过离心去除细胞，并将上清液作为含有抗体片段的周质组分用于elisa和facs验证实验。
[0292]
4)对于用于证实与pd
‑
l1抗原蛋白的结合的elisa验证实验，将约100ng/孔的抗原蛋白溶解在100μl pbs缓冲液中，并在4℃下孵育过夜，从而用其包被一半孔大小的elisa板(corning，3690)。第二天，将缓冲液更换为约170μl含有3％bsa的pbs缓冲液，接着通过在37℃下孵育约1小时进行封闭反应。
[0293]
5)从周质组分提取物得到的50μl上清液和50μl pbs在室温下孵育约1小时，使得抗体片段与包被的抗原蛋白结合，接着洗涤2
‑
3次。分配含有抗myc
‑
hrp或抗ha
‑
hrp二抗的pbs缓冲液，接着在室温下孵育约1小时，然后用pbs缓冲液洗涤2
‑
3次。
[0294]
6)每次分配100μl含有作为hrp底物的四甲基联苯胺(tmb)的elisa反应溶液，并通过观察显色反应确定抗体片段与pd
‑
l1抗原的结合。
[0295]
7)进行facs实验以验证所选择的抗体片段与在细胞表面上表达的天然构象的pd
‑
l1的结合。为此，通过转染在293t细胞中表达pd
‑
l1抗原蛋白，然后通过流式细胞术测定抗体片段与表面表达的pd
‑
l1抗原的结合，并且实验程序按一般facs实验方法进行。
[0296]
8)使引入了pd
‑
l1蛋白表达载体的293t细胞分裂以便获得约5x105至1x106个细胞/100μl，将其分配于96孔v型底板中，进行封闭反应，并使之与含有pd
‑
l1抗体片段的周质组分与pbs缓冲液在4℃下(或冰上)的100μl 1:1混合溶液反应约30至60分钟，从而诱导抗体片段与抗原蛋白的结合。此后，通过离心(1,000rpm，在4℃下1分钟)去除未结合的组分，用facs缓冲液进行洗涤，将所得细胞重悬于含有1:400稀释的抗标记alexa fluor 488二抗的facs缓冲液中，接着在4℃下反应另外30至60分钟。此后，通过离心(1,000rpm，1分钟，4℃)去除未结合的组分，将荧光标记的细胞重悬于400至700μlfacs缓冲液中，并使用facscalibur(becton dickinson)流式细胞仪分析是否存在细胞的荧光染色。
[0297]
如图1中所示，从pd
‑
l1蛋白淘选实验的第3次和第4次洗脱衍生的约1800个菌落获
得周质组分，进行elisa反应以验证其与包被在96孔板上的pd
‑
l1抗原蛋白的结合，并对展现出显色反应的克隆进行测序。作为结果，获得了约72种单独的抗体克隆。
[0298]
如图2中所示，基于对引入了pd
‑
l1蛋白的293t细胞进行facs以验证天然构象的这72种单独克隆与pd
‑
l1蛋白结合的能力的结果，发现多个抗体与表达pd
‑
l1蛋白的细胞的表面结合。
[0299]
实施例5.基于bli技术的pd
‑
1/pd
‑
l1结合抑制测定
[0300]
1)使用可由pall获得的octet装置，基于“生物层干涉测量(bli)”的原理进行了用于选择功能性抗体的实验。具体地，进行ar2g生物传感器的水合、edc/磺基
‑
nhs的激活和使用包被有在ph为5的10mm醋酸钠中的5μg/ml pd
‑
1蛋白的1m乙醇胺使未反应的官能团失活，以及在1x运行缓冲液中的孵育，从而导致平衡。
[0301]
2)为了确定pd
‑
l1抗原蛋白与抗体片段的结合对pd
‑
l1抗原与pd
‑
1蛋白之间的相互作用的干扰作用，将用pd
‑
1蛋白包被的生物传感器浸入混合了pd
‑
l1抗原蛋白和pd
‑
l1结合抗体(或比较抗体)的孔中，并且测量了可归因于pd
‑
l1抗原蛋白在溶液中的结合的生物传感器表面的质量变化。
[0302]
3)实验结果使用所提供的用于与octet装置一起使用的数据分析软件来分析。
[0303]
如图3中所示，评价了溶液中的pd
‑
l1抗原蛋白与生物传感器上包被的pd
‑
1的结合是否通过以下方法被抑制：通过在pd
‑1‑
fc蛋白与octet生物传感器结合后所选择的scfv抗体和pd
‑
l1
‑
fc的依序反应使所选择的抗体与pd
‑
l1结合。
[0304]
使用octet装置测量具有不同重链和轻链可变区的单独抗体侯选物的结合抑制性能，因此，当抗体片段一起孵育时，鉴定出展现如下特征的大约50个或更多抗体候选物(总共72个候选抗体)：由于pd
‑
l1结合的减少而导致传感图模式增加。
[0305]
实施例6：igg转化
[0306]
1)使用一组用于扩增单独抗体的vh和vl区的人抗体引物对约58种单独抗体的可变区vh和vl进行pcr扩增，通过对单独抗体克隆测序进行鉴定，接着进行纯化。
[0307]
2)将vh片段用kpni或bamhi和nhei限制酶处理，纯化并插入用于重链表达的pcep4
‑
vh载体的相应限制酶位点中，并将vl片段用kpni或bamhi和bsiwi限制酶处理，纯化并插入用于轻链表达的pcep4
‑
vl载体的相应限制酶位点中，从而获得能够在动物细胞中表达单独抗体的载体(重链和轻链表达载体各58种类型)。
[0308]
3)使用可由qiagen获得的dna maxi
‑
prep试剂盒纯化每种载体，并使用可由polyplus获得的fectopro转染试剂用其转染freestyle 293
‑
f细胞，从而表达单独抗体。培养后，使用蛋白a树脂对所得上清液进行亲和纯化过程以纯化抗体蛋白。
[0309]
4)为了用作对照抗体，在各自亲本中鉴定出mk3475(其是由merck开发的pd
‑
1靶抗体)和mpdl3280a(其是由genentech开发的pd
‑
l1靶抗体)的重链和轻链可变区氨基酸，合成cdna并将其插入pcep4
‑
vh载体和pcep4
‑
vl载体中以制备表达载体，并对于候选抗体进行相同的程序，由此产生两种抗体，将这两种抗体纯化并用作对照抗体。
[0310]
[表4]
[0311]
mk3475和mpdl3280a抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列
[0312][0313]
实施例7.小鼠pd
‑
l1结合facs测定
[0314]
1)将来自表达小鼠pd
‑
l1的鼠结肠癌细胞系的“mc38”(5x106个细胞/10ml)细胞用100ng/ml ifn
‑
γ处理并培养约48小时以增加在癌细胞系的表面上pd
‑
l1的表达水平。
[0315]
2)培养后，使mc38细胞分裂以获得约5x105至1x106个细胞/100μl并分配于96孔v型底板中，接着按照一般facs实验方法进行封闭反应，然后使纯化的pd
‑
l1抗体以10μg/ml的浓度在4℃下(或在冰上)反应约30至60分钟，然后使用facs洗涤缓冲液通过离心(在4℃下以1,000rpm持续1分钟)洗涤并去除未结合的抗体。
[0316]
3)将结合抗体的细胞重悬于含有1:400稀释的山羊α
‑
人alexa fluor488二抗的facs缓冲液中，然后使其在4℃下反应约30至60分钟。此后，用facs洗涤缓冲液通过离心(在4℃下以1,000rpm持续1分钟)洗涤未结合的二抗。
[0317]
4)将细胞重悬于400至700μl facs缓冲液中，然后使用facscalibur(becton dickinson)流式细胞仪分析是否存在细胞的荧光染色，因此证实一抗与小鼠pd
‑
l1蛋白的表面结合的能力。
[0318]
如图4所示，基于通过facs使用以igg形式表达和纯化的候选抗体证实与表达小鼠pd
‑
l1的mc38细胞的表面结合的能力的结果，发现大量抗体展现出与小鼠pd
‑
l1结合的能力。特别地，证实了kl001(pl110)和pl112抗体具有非常强的结合能力。
[0319]
实施例8.pd
‑
1/pd
‑
l1结合阻断测定
[0320]
1)各种实验方法已知为用于证实pd
‑
1免疫检查点蛋白和作为其配体的pd
‑
l1蛋白的结合抑制性能的基于体外细胞的功效验证方法，但所选择的抗体克隆的pd
‑
l1性能抑制能力使用“pd
‑
1/pd
‑
l1阻断生物测定”(其是由promega提供的基于细胞的测定试剂盒)来验证，并且在promega试剂盒中，对于细胞所测量的发光值的强度与pd
‑
1/pd
‑
l1结合抑制性能
的强度成比例。
[0321]
2)所述实验按照promega试剂盒中提供的方案进行，并且简要总结如下。
[0322]
3)在测定前一天，将“解冻即用的pd
‑
l1细胞”在37℃下水浴中解冻，添加至细胞回收培养基中，并在轻轻搅拌下混合，然后使用多通道移液器将其每次分配约100μl至白底测定板中，接着孵育过夜。
[0323]
4)在测定当天，倒出上清液，并将用于功效评价的样品即系列稀释液、比较抗体和候选抗体样品以40μl的溶液体积添加至每孔中，然后将解冻即用的pd1效应细胞(cs187105)从冰箱中取出，在37℃下水浴中解冻，并小心地悬浮于分析缓冲液中，并将其40μl分配到每个用抗体样品处理过的孔中。
[0324]
5)使jurkat细胞(pd
‑
1效应细胞)的激活抑制反应在37℃下在co2培养箱中进行6小时，并将加热至温热的80μl含有萤光素酶底物的bio
‑
glo萤光素酶测定溶液置于每个孔中，并使用victor多标记读板器(perkin elmer)测量发光值。
[0325]
如图5中所示，基于通过promega对以igg形式纯化的58个pd
‑
l1结合抗体的体外pd
‑
1/pd
‑
l1阻断生物测定的结果，证实发现了类似于用作对照抗体的pd
‑
1靶抗体(mk3475抗体)和pd
‑
l1靶抗体(mpdl3280a抗体)的具有强pd
‑
1/pd
‑
l1结合抑制性能的候选克隆。
[0326]
候选抗体的pd
‑
1/pd
‑
l1结合抑制性能取为相对于mk3475抗体的100％抑制性能的值，并且#50克隆和kl001克隆分别展现出91％和89％抑制性能。kl001克隆显示出对人
‑
鼠pd
‑
l1抗原的交叉反应性，并且#50克隆显示出仅与人pd
‑
l1结合的特征，并且这些克隆分别命名为开发候选代号kl001和kl002。
[0327]
实施例9.体内mc38/c57bl/6同基因小鼠模型研究
[0328]
1)将鼠结肠癌mc38细胞在补充有10％胎牛血清的培养基中在37℃和5％co2下培养约1周，并检查其形态、活力、倍增时间和支原体污染。制备正常状态的未污染的癌细胞用于动物实验，并且当注入实验动物中时，使用细胞活力为95％或更高的细胞。
[0329]
2)使用胰蛋白酶
‑
edta收获mc38细胞，并将其以1x107个细胞/ml的浓度悬浮于冷pbs中以供移植，并使用注射器将由此制备的细胞悬浮液以5x105个细胞/50μl的量皮下注射至c57bl/6小鼠的右后腿中以进行移植。此后，定期观察肿瘤形成和生长，并通过将测量的肿瘤长度代入下式来计算肿瘤体积。
[0330]
[肿瘤体积＝(a2b)/2；a＝肿瘤的短长度，b＝肿瘤的长长度]
[0331]
3)当肿瘤大小达到80mm3±
20时，根据体积将小鼠重新分类并分为对照组(pbs治疗组和比较抗体治疗组)和4种类型的pd
‑
l1靶抗体治疗组，通过腹膜内注射施用200μg/200μl抗体样品，并将注射周期设定为3次(1天、4天、7天)，在第一次注射后间隔3天。
[0332]
4)用抗体样品开始治疗前每3天且在治疗开始后每2天测量癌组织的生长，并使用从用抗体样品治疗的开始日期到实验结束(约2周)的肿瘤体积创建肿瘤生长曲线，并准备用作抗体功效评价的验证数据。当肿瘤体积达到由机构动物护理和使用委员会(institutional animal care and use committee，iacuc)确定的极限时，对相应的动物实施安乐死。实验结束时，对小鼠实施安乐死，并切除肿瘤，将肿瘤称重，并拍摄肿瘤的形状。
[0333]
5)为了比较在体内功效评价实验中显示出高抑制性能的抗体和显示出中等性能的抗体的体内抗癌性能，使用四种类型的抗体#50(＝kl002)、kl001(pl110)、#8和#61以及
对照抗体mpdl3280a进行体内功效评价实验。
[0334]
如图6中所示，基于使用小鼠来源的结肠癌细胞系mc38和c57bl/6同基因小鼠模型对候选抗体的体内抗癌性能的分析的结果，具有人
‑
鼠交叉反应性的kl001(pl110)抗体候选物展现出优异的抗癌功效，并且仅与人pd
‑
l1结合的#50(＝kl002)抗体没有展现出抗癌功效。
[0335]
此外，对于在体外功效实验中没有显示出高性能的克隆#8和#61，体内抗癌功效性能不是很高。
[0336]
实施例10.kl001抗体的离体免疫调节活性测试
[0337]
1)为了通过证实以下事实来验证候选抗体对血液中的免疫细胞之间相互作用的离体功效：在由于在人体中免疫细胞之间的免疫激活条件中诱导的pd
‑
1/pd
‑
l1结合导致的免疫活性受限现象中是否可以通过pd
‑
l1靶候选抗体的结合来增强免疫活性，从人血液分离外周血单核细胞(pbmc)，用超级抗原刺激pbmc，将sea或seb用免疫抗癌抗体处理，并测量免疫细胞之间活性的变化。
[0338]
2)在获得韩国红十字会血液管理本部(blood management headquarters of the korean red cross)的机构审查委员会(irb)批准后，从江原血液中心(gangwon blood center)购买红细胞浓缩液(crbc)，将其用pbs以1:1稀释，在ficoll
‑
paque上离心，根据细胞的比重分离红细胞(rbc)、外周血单核细胞(pbmc)和血浆，并提取pbmc部分并将其用于实验。
[0339]
3)将分离的外周血单核细胞(pbmc)以1x105个细胞/100μl分配到96孔(u型底)中，然后将每个孔用0.003μg/100μl seb(葡萄球菌肠毒素b，超级抗原，toxin technology)处理，然后用实验组和对照组抗体各10μg/ml处理以产生用于激活免疫细胞的条件。96小时后，使用il
‑
2elisa试剂盒定量由于在细胞培养基中对免疫细胞激活而产生的il
‑
2的量，从而验证候选抗体对人免疫细胞的免疫调节活性。
[0340]
如图7和图8中所示，在通过seb测定的免疫细胞激活测定中，证实在seb处理期间在apc与t细胞之间发生随机交联并且免疫细胞活性增加，从而增加il
‑
2分泌。证实了先前选择的候选抗体(kl001)的免疫细胞激活能力(图显示出五次实验的平均值)，并且在候选抗体亲和力成熟后选择的kl001
‑
13候选抗体也被证实展现出调节免疫细胞活性的相似能力。
[0341]
[表5]
[0342]
候选抗体的序列
[0343]
[0344]
[0345]
[0346][0347]
实施例11.亲和力成熟实验
[0348]
1)通过在kl001抗体的基本骨架中的重链cdr 2和3区以及轻链cdr 1和3区中集中
引入诱变，构建集中诱变文库。
[0349]
2)使用延伸pcr将在kl001克隆的vh和vl区引入了诱变的片段作为用于文库构建的插入片段进行扩增，将kl001片段用限制酶处理以克隆至噬菌体展示载体“pcomb3xss”中，并对相同限制酶处理过的载体进行连接反应。
[0350]
3)将连接的pcomb3x噬菌体展示载体和插入片段转化至使用er2738细胞产生的能进行电穿孔的细胞中，以构建kl001抗体展示突变文库。
[0351]
4)使用vcsm13辅助噬菌体，产生展示kl001突变抗体的噬菌体，然后将其通过使用peg和nacl的沉淀过程进行纯化。
[0352]
5)使用生物素化的pd
‑
l1
‑
fc抗原进行3
‑
4个淘选轮次，将从第3和第4个淘选轮次获得的菌落用于elisa反应，以进行亲和力改善的抗体选择。
[0353]
6)使用iptg在周质中表达所选择的抗体片段，使用蔗糖获得周质级分，然后使用包被有pd
‑
l1抗原的板通过elisa选择预期显示出增加的结合能力的候选抗体。
[0354]
7)使用竞争性elisa完成具有增加的结合能力的候选抗体的选择。
[0355]
如图9中所示，通过在kl001抗体的重链cdr 2和3区和轻链cdr 1和3区中引入定点诱变产生的集中诱变dna片段通过重叠pcr进行连接以制备fab型抗体骨架，然后将其通过连接插入噬菌体展示载体“pcomb3xss”的sfii限制酶位点中，并通过电穿孔转化至大肠杆菌er2738细胞中以供噬菌体展示，从而构建“1.3x10
9”大小的kl001抗体展示突变文库。为了使用生物素化的pd
‑
l1
‑
fc抗原富集具有强结合能力的抗体克隆，在严格的实验条件下以减少抗原量的方式进行3
‑
4个淘选轮次。此处，从淘选的输入与输出测量结果证实，通过淘选有效地增加了强结合剂的量。
[0356]
如图10中所示，从第3和第4个淘选轮次产生的约1600个单独菌落(set1至set16)获得周质级分，进行用于亲和力改善的抗体选择的elisa反应，并初步选择显示出阳性信号的候选克隆(约130个)。
[0357]
进行竞争性elisa以确定抗原结合能力是否改善(或koff值是否改善)，在含有pd
‑
l1抗原蛋白的溶液中孵育另外约4小时，并证实维持结合的抗体克隆，因此鉴定出与kl001相比，约27种类型的抗体候选物与板上包被的pd
‑
l1强烈结合(作为比较组的原始抗体kl001显示出elisa值为“0.278”，并且亲和力改善的抗体被鉴定为代表高于该值的克隆)。
[0358]
如下表6中所示，通过对预期显示出增加的结合能力的所有抗体进行测序，鉴定出引入了不同突变的抗体的氨基酸序列。
[0359]
[表6]
[0360]
[0361][0362]
为了测量亲和力改善的抗体由于pd
‑
l1抗原蛋白与抗体片段的结合而干扰pd
‑
l1抗原与pd
‑
1蛋白之间的相互作用的能力，将用pd
‑
1蛋白包被的生物传感器浸入混合了pd
‑
l1抗原蛋白和pd
‑
l1结合抗体(或比较抗体)的孔中，并且因此使用实施例5中提到的基于bli的octet装置测量了可归因于pd
‑
l1抗原蛋白在溶液中的结合的生物传感器表面的质量变化。
[0363]
下表7显示了使用用于与octet装置一起使用而专门提供的数据分析软件分析的亲和力改善的抗体的结合能力的结果。
[0364]
[表7]
[0365]
亲和力改善的抗体的结合能力
[0366]
编号样品idkd(m)r21mpdl3280a2.089e
‑
110.99782kl001(pl110)5.842e
‑
110.99943kl001
‑
022.160e
‑
110.99874kl001
‑
041.362e
‑
110.99755kl001
‑
061.686e
‑
110.99816kl001
‑
071.367e
‑
110.99887kl001
‑
081.417e
‑
110.99918kl001
‑
092.165e
‑
110.99869kl001
‑
102.007e
‑
110.998510kl001
‑
111.629e
‑
110.99811kl001
‑
121.502e
‑
110.999112kl001
‑
134.885e
‑
120.998813kl001
‑
142.044e
‑
110.999214kl001
‑
155.798e
‑
120.998215kl001
‑
169.082e
‑
120.998116kl001
‑
171.827e
‑
110.998917kl001
‑
181.607e
‑
110.998318kl001
‑
196.552e
‑
120.998319kl001
‑
202.128e
‑
110.998220kl001
‑
212.831e
‑
110.998621kl001
‑
224.903e
‑
110.998622kl001
‑
232.674e
‑
110.998923kl001
‑
244.078e
‑
110.999224kl001
‑
265.722e
‑
110.999125kl001
‑
276.117e
‑
110.9986
[0367]
实施例12.biacore测定
[0368]
1)为了测量候选抗体与pd
‑
l1抗原蛋白结合的能力，结合强度使用基于表面等离子体共振(spr)原理的biacore t200装置来测量。
[0369]
2)在使用抗体捕获方法分析抗pd
‑
l1抗体的结合亲和力时，首先根据制造商提供的实验方法的指南使用人抗体捕获试剂盒将抗人igg(fc)抗体固定在cm5芯片的表面，并将候选抗体kl001
‑
8和kl001
‑
13在pbs
‑
p运行缓冲液中稀释，以10μl/min的流速注射30秒，并
在300至330ru的水平下捕获，然后将人pd
‑
l1抗原蛋白(sino biological)从5nm系列稀释2倍，并在30μl/min的流速下观察缔合和解离反应(各自的反应时间设置为4和7分钟)。在对小鼠pd
‑
l1抗原蛋白的结合能力的测量中，通过从10nm开始系列稀释2倍以及在30μl/min的流速下缔合和解离分别持续4min和3min来测量结合能力。
[0370]
3)为了在每个循环中去除结合的抗体，以30μl/min的流速注射再生溶液(3m mgcl2)30秒，并使用bia评价软件1.0版的1:1结合模型获得实验数据。
[0371]
4)在使用抗原捕获方法分析抗pd
‑
l1抗体结合亲和力的实验中，根据制造商的说明书使用his捕获试剂盒将抗his抗体固定在cm5芯片的表面，捕获pd
‑
l1抗原蛋白，将候选抗体从2.5nm系列稀释2倍，并通过在30μl/min的流速下缔合和解离分别持续4min和7min来测量其结合能力。
[0372]
如图11中所示，抗人igg(fc)抗体被固定在3号和4号流动池中。根据对于人抗体捕获试剂盒的说明书进行固定，表明了每个流动池中范围为约11,000至13,000ru的固定。抗体kl001
‑
8和kl001
‑
13使用运行缓冲液(pbs
‑
p)来捕获，将pd
‑
l1进行系列稀释并注射，并测量动力学，在此基础上证实kl001
‑
8抗体展现出对于人pd
‑
l1的kd＝6.714x10
‑
11
m和对于小鼠pd
‑
l1的6.401x10
‑9m的结合能力，并且kl001
‑
13抗体展现出对于人pd
‑
l1的约kd＝6.320x10
‑
11
m和对于小鼠pd
‑
l1的2.797x10
‑9m的结合能力。
[0373]
实施例13.使用体内同基因小鼠模型通过单一治疗评价抗癌功效
[0374]
使用体内同基因小鼠模型证实抗体侯选物的抗癌功效。
[0375]
如图12中所示，将两种类型的性能优化抗体和mpdl3280a抗体腹膜内施用于mc38皮下同基因小鼠模型中，并评价其肿瘤生长抑制功效。相对于施用pbs的对照组，mpdl3280a组显示出94.3％抑制，kl001(pl110)组显示出97.5％抑制，结合亲和力改善的抗体kl001
‑
13组显示出98.9％抑制，并且观察到没有由于药物而导致的体重变化。
[0376]
[表8]
[0377][0378]
表显示出tgi的结果(肿瘤生长抑制％，tgi％＝(1
‑
(t/c))x100)
[0379]
实施例14.用于验证体外功效的ic50测量
[0380]
1)为了证实通过研究获得的用于改善亲和力和物理特性的候选抗体与比较抗体相比之下的体内性能改善效果，使用promega提供的“pd
‑
1/pd
‑
l1阻断生物测定”试剂盒通过测量系列稀释的候选抗体和比较抗体样品的pd
‑
1/pd
‑
l1结合抑制能力来验证抑制作用的ic50值。
[0381]
2)所述实验按照promega试剂盒中提供的方案进行，并且总结如下。
[0382]
3)在测定前一天，将“解冻即用的pd
‑
l1细胞”在37℃下水浴中解冻，添加至细胞回
收培养基中，并在轻轻搅拌下混合，并且使用多通道移液器将其每次分配约100μl至白底测定板中，接着孵育过夜。
[0383]
4)在测定当天，倒出上清液，并将用于功效评价的样品即系列稀释液、比较抗体和候选抗体样品以40μl的溶液体积添加至每孔中，然后将解冻即用的pd1效应细胞(cs187105)从冰箱中取出，在37℃下水浴中解冻，并小心地悬浮于分析缓冲液中，并将其40μl分配到每个用抗体样品处理过的孔中。
[0384]
5)使jurkat细胞激活抑制反应在37℃下在co2培养箱中进行6小时，将加热至温热的80μl含有萤光素酶底物的bio
‑
glo萤光素酶测定溶液添加至每个孔中，并使用victor多标记读板器(perkin elmer)测量发光值。
[0385]
如图13中所示，基于通过使用基于体外细胞的测定测量所选择的抗体的ic50值来证实所选择的抗体的性能水平的结果，与比较抗体mpdl3280a相比，大多数亲和力改善的抗体候选物具有低ic50浓度值，这表明调节免疫活性的能力得到改善。
[0386]
[表9]
[0387]
ic50测量结果
[0388][0389]
实施例15.通过体内组合治疗得到的抗癌效果的评价
[0390]
1)为了验证在pd
‑
l1免疫抗癌抗体候选物与其他抗癌剂组合使用时在抗癌性能评价动物模型中是否观察到协同作用，进行了一项实验以验证代表性免疫激活蛋白即重组il
‑
2(一种ctla
‑
4抗体(9d9克隆，bioxcell))和pd
‑
l1靶候选抗体(kl001
‑
13)在组合使用时的功效。
[0391]
2)为了开发使用kl001
‑
13抗体的组合疗法时，使用mc38小鼠结肠癌细胞系和6周龄c57bl/6雄性(
♂
)小鼠模型进行组合治疗实验，将组分为总共8组，包括单独施用pbs、il
‑
2、ctla
‑
4和kl001
‑
13的四组以及共同施用il
‑
2 kl001
‑
13、ctla
‑
4 kl001
‑
13、il
‑
2 mpdl3280a和ctla
‑
4 mpdl3280a的四组，各组8只小鼠(n＝8)。
[0392]
3)将小鼠结肠癌mc38细胞系以70％
‑
90％细胞密度培养，用0.25％胰蛋白酶
‑
edta处理，收获，并以1x106个细胞/100μl的细胞浓度重悬于dmem培养基(无血清)中，以制备细胞活力≥95％的mc38细胞样品，然后以1x106个细胞/100μl的量皮下注射至用2.5％阿佛丁麻醉的c57bl/6小鼠身体的左侧中，并使其在实验动物小鼠中生长约7至10天，直到注射的mc38细胞系的肿瘤大小达到100mm3。此处，肿瘤的大小计算如下。
[0393]
[肿瘤体积＝(a2b)/2；a＝肿瘤的短长度，b＝肿瘤的长长度]
[0394]
4)当肿瘤的大小达到100mm3时，将制备的pbs、候选抗体、比较抗体和细胞因子il
‑
2单独或组合腹膜内注射。此处，将kl001
‑
13、mpdl3280a和ctla
‑
4抗体以10mg/kg(200μg/
100μl)的浓度以3天的间隔单独或组合施用总共4次，并且将il
‑
2细胞因子以1x104iu/100μl的浓度以2天的间隔单独或组合施用总共5次。每周测量肿瘤大小(mm3)3次，并观察肿瘤的生长程度。在验证il
‑
2与kl001
‑
13抗体的组合功效的测试中，由于il
‑
2在动物体内的半衰期短，在动物实验中一般每天施用il
‑
2，但在本实验中il
‑
2每2天以少量施用，以确定il
‑
2作为免疫活性刺激剂在与pd
‑
l1靶抗体组合使用时是否展现出协同作用。
[0395]
如图14中所示，当il
‑
2和kl001
‑
13抗体组合施用时，可以观察到与il
‑
2和kl001
‑
13抗体单独施用时相比抗癌功效显著增加，并且其抗癌效果也优于il
‑
2和比较组中治疗所用的可从genentech获得的mpdl3280a抗体的组合效果。
[0396]
如图15中所示，基于免疫检查点蛋白ctla
‑
4靶抗体(9d9克隆，bioxcell)和kl001
‑
13抗体单独或组合施用的功效的验证结果，与单独施用ctla
‑
4抗体的组相比，在单独施用pd
‑
l1的组中观察到良好的抗癌效果，并且当这两种抗体组合施用时，展现出突出的协同作用，以至于观察到癌细胞被完全杀死的许多情况。特别地，观察到kl001
‑
13抗体的组合效果优于ctla
‑
4抗体和用作比较抗体的可从genentech获得的mpdl3280a抗体的组合效果。
[0397]
【工业实用性】
[0398]
根据本发明，可以证实与pd
‑
l1结合的抗体或其抗原结合片段展现出人
‑
小鼠、人
‑
猴和人
‑
狗交叉反应性，以非常高的亲和力与pd
‑
l1结合，并抑制pd
‑
1/pd
‑
l1复合物的形成。另外，在基于体外细胞的测定、体内功效实验和组合疗法实验中可以展现出优异的效果。因此，根据本发明的与pd
‑
l1结合的抗体或其抗原结合片段可以根据需要有效地用于预防或治疗癌症，并且当与另一种抗癌剂组合使用时可以展现出协同作用。
[0399]
尽管已如上所述详细公开了本发明的具体实施方案，但对于本领域中的普通技术人员清楚的是，描述仅为优选的示例性实施方案且不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同物定义。
[0400]
【序列表自由文本】
[0401]
附有电子文件。