人CFAP65基因的用途及相关产品的制作方法

人cfap65基因的用途及相关产品
技术领域
1.本发明属于生物医药研究领域，具体涉及人cfap65基因的用途及相关产品。


背景技术：

2.cfap65是一种蛋白质编码基因。与cfap65相关的疾病包括精子发育失败和由于精子运动障碍引起的非综合男性不育症。该基因可能在精子运动中起作用，基因编码的蛋白可能是跨膜蛋白，具有推定的卷曲螺旋结构域。该基因的直系同源基因参与了rose-comb突变，是一个大的染色体倒置，导致梳状形态改变和精子活动性缺陷(wang w,et al.biallelic mutations in cfap65 lead to severe asthenoteratospermia due to acrosome hypoplasia and flagellum malformations.j med genet.2019.pmid:31501240)。人线粒体转录因子a(tfam)与促进肿瘤生长和侵袭有关。tfam激活线粒体dna(mtdna)转录，并通过线粒体逆行信号传导影响核基因表达。敲除cfap65(纤毛和鞭毛相关蛋白65)或pck1(胞质磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶)可拯救tfam耗竭对细胞形态和增殖的影响。研究发现pck1在钙介导的逆向信号传导中作用于cfap65的下游。此外，2'，3'-二脱氧胞苷的mtdna消耗足以诱导cfap65和pck1表达并抑制细胞增殖。因此，tfam-mtdna-钙-cfap65-pck1轴参与线粒体逆行信号传导，影响肿瘤细胞的分化和增殖(transcriptomic analysis of mitochondrial tfam depletion changing cell morphology and proliferation)。但是关于cfap65在肿瘤相关领域的报道很少。


技术实现要素：

3.为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供人cfap65基因的用途及相关产品。
4.为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
5.本发明的第一方面，提供人cfap65基因作为靶标在制备胃癌治疗药物或者在制备胃癌诊断药物中的用途。
6.所述人cfap65基因作为靶标在制备胃癌治疗药物具体是指：将cfap65基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制人cfap65基因表达的药物作为胃癌治疗备选药物。如本发明所述的cfap65基因小分子干扰rna(sirna)即是以人cfap65基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制胃癌细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将cfap65基因作为作用对象。
7.所述将人cfap65基因作为靶标用于制备胃癌诊断药物具体是指：将cfap65基因表达产物作为一项胃癌诊断指标应用于胃癌诊断药物的制备。
8.所述胃癌治疗药物为能够特异性抑制cfap65基因的转录或翻译，或能够特异性抑制cfap65蛋白的表达或活性的分子，从而降低胃癌细胞中cfap65基因的表达水平，达到抑制胃癌细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
9.所述通过cfap65基因制备获得的胃癌治疗药物或者胃癌诊断药物包括但不限于：
核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
10.所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链rna(dsrna)、核酶、核糖核酸内切酶iii制备的小干扰rna或者短发夹rna(shrna)。
11.所述胃癌治疗药物的施用量为足够降低人cfap65基因的转录或翻译，或者足够降低人cfap65蛋白的表达或活性的剂量。以使人cfap65基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。
12.采用前述胃癌治疗药物治疗胃癌的方法，主要是通过降低人cfap65基因的表达水平抑制胃癌细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人cfap65基因表达水平的物质给药于患者。
13.在一种实施方式中，所述cfap65基因的靶标序列如seq id no：1所示。具体为：5
’-
ccttgaaactccagaagat-3’。
14.本发明的第二方面，提供cfap65抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：
15.治疗胃癌；
16.抑制胃癌细胞的增殖速率；
17.抑制胃癌生长。
18.所述产品必然包括cfap65抑制剂，并以cfap65抑制剂作为前述功效的有效成分。
19.所述产品中，发挥前述功用的有效成分可仅为cfap65抑制剂，亦可包含其他可起到前述功用的分子。
20.亦即，cfap65抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。
21.所述产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
22.所述产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
23.所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
24.所述产品包括但不限于药物、保健品、食品等。
25.所述cfap65抑制剂可以为核酸分子、抗体、小分子化合物。
26.如本发明实施例列举的，所述cfap65抑制剂可以为降低胃癌细胞中cfap65基因表达的核酸分子。具体的，可以是双链rna或shrna。
27.本发明的第三方面，提供了一种治疗胃癌的方法，为向对象施用cfap65抑制剂。
28.所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的胃癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述胃癌细胞可以为离体胃癌细胞。
29.所述对象可以是罹患胃癌的患者或者期待治疗的胃癌的个体。或者所述对象为胃癌患者或者期待治疗胃癌的个体的离体胃癌细胞。
30.所述cfap65抑制剂可以在接受胃癌治疗前、中、后向对象施用。
31.本发明第四方面公开了一种降低胃癌细胞中cfap65基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含双链rna或shrna。
32.其中，所述双链rna中含有能够与cfap65基因杂交的核苷酸序列；
1xlaco、plko-puro-iptg-3xlaco、plp1、plp2、plp/vsv-g、pentr/u6、plenti6/block-it-dest、plenti6-gw/u6-laminshrna、pcdna1.2/v5-gw/lacz、plenti6.2/n-lumio/v5-dest、pgcsil-gfp或plenti6.2/n-lumio/v5-gw/lacz中的任一。
51.本发明实施例具体列举了以pgcsil-gfp为载体构建的人cfap65基因干扰慢病毒载体，命名为pgcsil-gfp-cfap65-sirna。
52.本发明的cfap65基因sirna可用于抑制胃癌细胞的增殖，进一步地可以用作治疗胃癌的药物或制剂。cfap65基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述cfap65基因sirna。当用作治疗胃癌的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
53.本发明第六方面，公开了一种cfap65基因干扰慢病毒，由前述cfap65基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染胃癌细胞并产生针对cfap65基因的小分子干扰rna，从而抑制胃癌细胞的增殖。该cfap65基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗胃癌的药物。
54.本发明的第七方面，提供前述核酸分子，或前述cfap65基因干扰核酸构建体，或前述cfap65基因干扰慢病毒的用途，为：用于制备预防或治疗胃癌的药物，或用于制备降低胃癌细胞中cfap65基因表达的试剂盒。
55.所述预防或治疗胃癌的药物的应用为胃癌的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内胃癌的方法，包括将有效剂量的所述的药物施用于对象中。
56.进一步的，所述药物用于预防或治疗对象体内胃癌时，需要将有效剂量的所述的药物施用于对象中。采用该方法，所述胃癌的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述胃癌的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
57.所述方法的对象可以为人。
58.本发明的第八方面，提供一种用于预防或治疗胃癌的组合物，其有效物质含有：
59.前述的核酸分子；和/或，前述cfap65基因干扰核酸构建体；和/或，前述cfap65基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
60.所述组合物可以为药物组合物。
61.当所述组合物用于预防或治疗对象体内胃癌时，需要将有效剂量的所述的组合物施用于对象中。采用该方法，所述胃癌的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述胃癌的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
62.所述组合物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
63.所述组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
64.综上所述，本发明设计了针对人cfap65基因的rnai靶点序列，构建相应的cfap65rnai载体，其中rnai载体pgcsil-gfp-cfap65-sirna能够显著下调cfap65基因在mrna水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为lv)作为基因操作工具携带rnai载体pgcsil-gfp-cfap65-sirna能够靶向地将针对cfap65基因的rnai序列高效导入胃
癌ags细胞，降低cfap65基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的cfap65基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
65.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
66.本发明经过广泛而深入的研究发现，采用rnai方法下调人cfap65基因的表达后可有效地抑制胃癌细胞的增殖，可以有效地控制胃癌的生长进程。这一研究成果表明cfap65基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。本发明提供的sirna或者包含该sirna序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制胃癌细胞的增殖速率、抑制胃癌生长，从而治疗胃癌，为胃癌治疗开辟新的方向。
附图说明
67.图1：rt-pcr检测ags细胞mrna水平靶基因消减效率。
68.图2：celigo细胞自动分析结果揭示cfap65基因的消减抑制胃癌细胞的增殖。(细胞系为ags细胞，病毒感染后1，2，3，4以及5天分别对细胞数量进行统计)
69.附图中，
70.柱形图代表三次实验的平均值，误差线表示标准偏差(sd)。
71.**,shctrl与目的基因shrna慢病毒处理组相比，p《0.01。
具体实施方式
72.本发明从细胞功能学角度出发证实cfap65基因在胃癌发生中的作用。通过构建目的基因shrna慢病毒后转染胃癌细胞，与转染对照慢病毒做对比，检测两组胃癌细胞系内mrna及蛋白质水平目的基因的表达情况；随后通过细胞功能学实验进行细胞增殖等检测，结果显示shrna组与对照组对比，shrna组胃癌细胞增殖抑制程度明显高于对照组。
73.依据上述研究结果，进一步探索，开发针对该基因的诊断治疗新方法，能给胃癌患者的诊断治疗提供更多选择。
74.cfap65抑制剂
75.指对于cfap65具有抑制效果的分子。对于cfap65具有抑制效果包括但不限于：抑制cfap65的表达或活性。
76.抑制cfap65活性是指使cfap65活力下降。优选地，相比抑制前，cfap65活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。
77.抑制cfap65表达具体的可以是抑制cfap65基因的转录或翻译，具体的，可以是指：使cfap65的基因不转录，或降低cfap65的基因的转录活性，或者使cfap65的基因不翻译，或降低cfap65的基因的翻译水平。
78.本领域技术人员可以使用常规方法对cfap65的基因表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰rna等。
79.cfap65的基因表达的抑制可以通过pcr及western blot检测表达量验证。
80.优选地，与野生型相比，cfap65基因表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地cfap65基因完全没有表达。
81.小分子化合物
82.本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。
83.制备预防或治疗胃癌的药物
84.可以利用降低胃癌细胞中cfap65基因表达的核酸分子；和/或，cfap65基因干扰核酸构建体；和/或，cfap65基因干扰慢病毒，作为有效成分，制备预防或治疗胃癌的药物。通常，所述药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
[0085]“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
[0086]“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
[0087]
本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
[0088]
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0089]
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0090]
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。
[0091]
实施例1针对人cfap65基因rnai慢病毒的制备
[0092]
1.筛选针对人cfap65基因的有效的sirna靶点
[0093]
从genbank调取cfap65(nm_194302)基因信息；设计针对cfap65基因的有效的sirna靶点。表1-1列出了筛选出的针对cfap65基因的有效sirna靶点序列。
[0094]
表1-1 靶向于人cfap65基因的sirna靶点序列
[0095]
seq id notargetseq(5'-3')1ccttgaaactccagaagat
[0096]
2.慢病毒载体的制备
[0097]
针对sirna靶点(以seq id no：1为例)合成两端含age i和ecor i酶切位点粘端的双链dna oligo序列(表1-2)；以age i和ecor i限制性内切酶作用于pgcsil-gfp载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
[0098]
表1-2 两端含age i和ecor i酶切位点粘端的双链dna oligo
[0099][0100]
通过t4 dna连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表1-4所示，37℃，反应1h)的载体dna和纯化好的双链dna oligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表1-5所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl lb培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中rnai序列的上下游，设计通用pcr引物，上游引物序列：5
’-
ccaagtgaccagcggattgac-3’(seq id no：6)；下游引物序列：5
’-
gggttgaggcagcaaaagatg-3’(seq id no：7)，进行pcr鉴定实验(pcr反应体系如表1-6，反应条件如表1-7)。对pcr鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对seq id no：1的表达rnai的载体，命名为pgcsil-gfp-cfap65-sirna。
[0101]
构建pgcsil-gfp-scr-sirna阴性对照质粒，阴性对照sirna靶序列为5
’-
ttctccgaacgtgtcacgt-3’(seq id no：8)。构建pgcsil-gfp-scr-sirna阴性对照质粒时，针对scr sirna靶点合成两端含age i和ecor i酶切位点粘端的双链dna oligo序列(表1-3)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同pgcsil-gfp-cfap65-sirna。
[0102]
表1-3 两端含age i和ecor i酶切位点粘端的双链dna oligo
[0103][0104]
表1-4 pgcsil-gfp质粒酶切反应体系
[0105]
试剂体积(μl)pgcsil-gfp质粒(1μg/μl)2.010
×
buffer5.0100
×
bsa0.5age i(10u/μl)1.0
ecor i(10u/μl)1.0dd h2o40.5total50.0
[0106]
表1-5 载体dna和双链dna oligo连接反应体系
[0107]
试剂阳性对照(μl)自连对照(μl)连接组(μl)线性化的载体dna(100ng/μl)1.01.01.0退火的双链dna oligo(100ng/μl)1.0-1.010
×
t4噬菌体dna连接酶缓冲液1.01.01.0t4噬菌体dna连接酶1.01.01.0dd h2o16.017.016.0total20.020.020.0
[0108]
表1-6 pcr反应体系
[0109]
试剂体积(μl)10
×
buffer2.0dntps(2.5mm)0.8上游引物0.4下游引物0.4taq聚合酶0.2模板1.0ddh2o15.2total20.0
[0110]
表1-7 pcr反应体系程序设定
[0111][0112]
3.包装cfap65-shrna慢病毒
[0113]
以qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取rnai质粒pgcsil-gfp-cfap65-sirna的dna，配制成100ng/μl储存液。
[0114]
转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293t细胞，以含10％胎牛血清的dmem完全培养基调整细胞密度为1.5
×
105细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％co2培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照sigma-aldrich公司的mission lentiviral packaging mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入packing mix(pvm)20μl，pei 12μl，无血清dmem培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒dna，加至上述pvm/pei/dmem混合液。
[0115]
将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293t细胞的培养基中，37℃，5％co2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，pbs溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，centricon plus-20离心超滤装置(millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过
mrna的表达水平下调了70.4％。
[0124]
实施例3检测侵染了cfap65-shrna慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
[0125]
处于对数生长期的人胃癌ags细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5
×
104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(moi，ags：10)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2
×
104/ml)，以细胞密度约为1500个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％co2培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用celigo仪器(nexcelom)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线(结果如图2所示)。结果表明，慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，活力细胞数目下降了59.3％，表明cfap65基因沉默导致人胃癌ags细胞增殖能力被抑制。
[0126]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。