一种从发酵液中分离纯化精氨酸脱羧酶的方法与流程

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种从发酵液中分离纯化精氨酸脱羧酶的方法。


背景技术：

2.精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase,adc)，是一种磷酸吡哆醛(plp)依赖型脱羧酶，以l-精氨酸为底物，脱去羧基后生成胍基丁胺。胍基丁胺作为一种重要的生物胺，具有很大的生理功能和医药价值。
3.adc广阔的应用前景引起了人们开发利用的浓厚兴趣。虽然精氨酸脱羧酶的来源在植物、动物和微生物体内广为分布，但目前精氨酸脱羧酶主要还是通过化学合成法和微生物发酵法两种制备得到，其中化学合成法因其步骤繁复、造成的污染严重，产物收率较低等缺点日益被微生物发酵法所取代。微生物发酵法是通过诱变菌株或重组工程菌株，让微生物发酵产生精氨酸脱羧酶。但是如何从发酵液中分离纯化精氨酸脱羧酶，却鲜有介绍，申请号为201910596902.9公开了一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法，将发酵液通过50nm陶瓷膜收集含精氨酸脱羧酶的全细胞菌体来得到精氨酸脱羧酶，但菌体中所含有的酶种类较多，并未报道如何分离纯化精氨酸脱羧酶。所以如何从发酵液中分离纯化精氨酸脱羧酶是需要解决的问题。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种从发酵液中分离纯化精氨酸脱羧酶的方法。该方法可显著提高精氨酸脱羧酶的收率和纯度。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种从发酵液中分离纯化精氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
7.(1)将含有精氨酸脱羧酶的发酵液的ph值调至4.2～4.6，然后依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤，收集滤液；
8.(2)将滤液用镍柱进行亲和层析，滤液挂柱后先用凝血酶溶液进行酶切，再进行洗脱，收集洗脱液即为混合液；
9.(3)混合液过苯甲眯-琼脂糖凝胶树脂进行洗脱，收集洗脱液再进行电渗析脱盐，最后浓缩结晶，干燥，得到精氨酸脱羧酶。
10.优选的，步骤(1)中，发酵液的ph值调至4.4；陶瓷膜的孔径为100nm，压力0.5mpa。
11.优选的，步骤(2)中，滤液挂柱所用的结合缓冲液为50mm的pbs。
12.优选的，步骤(2)中，酶切所用消化缓冲液为150mm nacl，ph7.0，消化温度30℃，切割10h。
13.优选的，步骤(2)中，所述凝血酶溶液是将凝血酶溶于生理盐水制得的；所述凝血酶的酶活为2000000u、比活大于2000u/mgpr。
14.优选的，步骤(2)中，所述凝血酶的用量：1mg精氨酸脱羧酶用2u凝血酶切割。
15.优选的，步骤(2)中，洗脱所用洗脱剂为生理盐水。
16.优选的，步骤(3)中，洗脱所用平衡缓冲液为50mm tris-hcl，0.5m nacl，ph7.4；洗脱所用结合缓冲液为50mm tris-hcl，0.5m nacl，ph7.4100cm/h，压力为0.3mpa。
17.优选的，步骤(3)中，所述电渗析脱盐的ph控制在5.7～6.1，温度控制在40℃以下，淡室电导≤1000μs/cm时电渗析结束。
18.本发明的有益效果：
19.本发明将脱色、陶瓷膜过滤、柱纯化、电渗析脱盐、结晶等技术手段有机的结合在一起，将精氨酸脱羧酶从发酵液中分离纯化出来。本发明分离纯化精氨酸脱羧酶的方法成本低、可以实现工业化生产，而且精氨酸脱羧酶的收率和纯度都有了显著提高。
具体实施方式
20.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
21.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
22.本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，如无特殊说明，均可通过商业渠道购买得到。
23.说明：实施例所用凝血酶购自北京博尔西科技有限公司，来源：牛血浆。
24.实施例1：发酵液的制备
25.1.制备精氨酸脱羧酶生产菌
26.发明人从现有数据库中获得的spea基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
27.(1)为了使spea基因能够更适用于原核表达系统，本发明分别对上述基因的核苷酸序列组成进行了密码子优化，并在优化后的spea基因的末端增加了gly-arg-gly-8his序列，如seq id no.2所示；得到优化后的spea基因(即目的基因)，如seq id no.3所示。
28.(2)对pg3启动子进行优化得到优化后的pg3启动子(seq id no.4所示)，将质粒pht304用ndeⅰ和hincⅱ双酶切处理，将优化后的pg3启动子整合在双酶切处理后的质粒pht304上，得到质粒pht304-pg3(seq id no.5所示)；
29.(3)将质粒pht304-pg3用sphⅰ和sacⅰ双酶切处理，将目的基因(seq id no.3所示)整合到双酶切处理后的质粒pht304-pg3上，得到重组表达载体(seq id no.6所示)。
30.2.精氨酸脱羧酶生产菌的构建
31.将重组表达载体导入枯草芽孢杆菌中，获得转化子。
32.将转化子在lb平板上涂布，等长出单菌落之后在amp平板(含50μg/ml amp的lb平板)上接种，待抗性平板上长出单菌落之后，amp平板中挑出生长的单菌落，将其作为阳性转化子。
33.将阳性转化子接种于发酵培养基(发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/l、酵母膏8g/l、氯化钠3g/l、硫酸铵2.5g/l、三水磷酸氢二钾4g/l、柠檬酸铁铵0.3g/l、柠檬酸2.1g/l、甘油10g/l、七水硫酸镁0.5g/l、硫酸卡那霉素100ppm、消泡剂0.5g/l，接种前用氨水调发酵培养基ph至6.9-7.0)中，发酵培养的温度为37℃，ph为6.9～7.0，溶氧(do)为20～40％；od为
20％时，降温至28℃，加入0.2mm iptg诱导发酵；保证诱导培养时间不少于14h，待od增长缓慢或不长时发酵结束。对培养后得到的发酵液进行破菌处理，4000r/min离心15min，收集上清液得到含有精氨酸脱羧酶的发酵液。
34.实施例2：从发酵液中分离纯化精氨酸脱羧酶
35.具体步骤如下：
36.(1)将含有精氨酸脱羧酶的发酵液的ph值调至4.4，然后依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤，陶瓷膜的孔径为100nm，压力0.5mpa，收集滤液。
37.(2)镍柱进行亲和层析：以50mm的pbs作为结合缓冲液，将滤液挂柱。将酶活为2000000u、比活大于2000u/mgpr的凝血酶溶于生理盐水得到凝血酶溶液，然后加入凝血酶溶液进行切割，消化缓冲液采用150mm nacl，ph7.0，消化温度30℃，切割10h。用生理盐水洗脱，收集洗脱液即为混合液。
38.镍柱的处理：使用完的镍柱用80mm的咪唑磷酸盐缓冲液为洗脱剂进行洗脱，洗脱剂的用量为5倍柱体积，流速为50cm/h，洗脱液收集后排入污水处理池。镍柱处理完后重复使用。
39.(3)混合液过苯甲眯-琼脂糖凝胶树脂除去凝血酶，所用平衡缓冲液：50mm tris-hcl，0.5m nacl，ph7.4，用结合缓冲液(50mm tris-hcl，0.5m nacl，ph7.4100cm/h 0.3mpa)吸收凝血酶，然后再回收凝血酶，凝血酶测定比活后可重新使用。洗脱后收集洗脱液，电渗析脱盐(电渗析的ph控制在5.9，温度控制在40℃以下；淡室电导≤1000μs/cm时，关闭电渗析，将淡水放出)，对电渗析放出的淡水进行旋转蒸发，温度50℃，50℃下干燥，然后冷冻干燥，预冻：每分钟温度降低15℃，降至-35℃；速冻：制冷板层-40℃，放入制品机器全速制冷，等待2h开始抽真空；升华干燥：真空值控制在10-30pa；解析干燥：缓慢升温至 40℃，真空值小于20pa；关闭冻干箱与冷凝器之间的真空阀门，观察60s，若压力上升小于0.5pa，冻干结束，得到精氨酸脱羧酶冻干粉。
40.苯甲眯-琼脂糖凝胶树脂的处理：使用完的苯甲眯-琼脂糖凝胶树脂洗脱剂10mm hcl，0.5m n乙酰半胱氨酸，ph2.0，洗脱。洗脱剂的用量为5倍柱体积，流速为50cm/h。苯甲眯-琼脂糖凝胶树脂处理完后重复使用。
41.对比例1：
42.将实施例2中的步骤(2)和步骤(3)省略。其余步骤同实施例2。
43.对比例2：
44.将实施例2中的步骤(3)省略。其余步骤同实施例2。
45.对比例3：
46.(1)将含有精氨酸脱羧酶的发酵液的ph值调至4.4，然后依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤，陶瓷膜的孔径为100nm，压力0.5mpa，收集滤液。
47.(2)将滤液挂镍柱，结合缓冲液为50mm的pbs，收集洗脱液即为混合液。
48.(3)混合液进行电渗析脱盐，最后浓缩结晶，干燥，得到精氨酸脱羧酶。
49.对本实施例2和对比例1-3纯化得到的精氨酸脱羧酶的收率和纯度进行测定。其中，收率是先直接测定发酵液中精氨酸脱羧酶的浓度，计算出应得精氨酸脱羧酶的量；再进行提纯，得到精品精氨酸脱羧酶后，按如下公式计算收率：
50.收率＝(精品精氨酸脱羧酶的量/应得精氨酸脱羧酶的量)*100％。
51.纯度是产品中精氨酸脱羧酶占产品的百分比。
52.发酵液中精氨酸脱羧酶的浓度检测方法：以纯度为97％的adc为标准品，梯度配置各种质量浓度的标准液，以质量浓度为横坐标，以od595为纵坐标，绘制标准曲线。得到的回归方程y＝3.5154x 0.002，相关系数r2＝0.9984，然后将发酵液的吸光度带入方程，计算得到发酵液中精氨酸脱羧酶的浓度。
53.精氨酸脱羧酶酶活测定方法：
54.在2ml反应体系中，添加50mm tris-hcl buffer(ph7.5)，1mm plp，0.1mm dtt，4mm mgs04，10mm l-arg，40℃水浴，取100mg冻干后的酶用纯水溶解，定容至100ml，用移液枪吸取1ml加入体系后开始反应，15min后加入1/5体积40％三氯乙酸终止反应。用hplc测定产物胍基丁胺含量。1个酶活力单位(u)定义为：在40℃，ph7.5条件下，每min生成1umol胍基丁胺所需的酶量为1个酶活力单位。
55.经测定，实施例2和对比例1-3纯化得到的精氨酸脱羧酶的收率和纯度结果如下：
56.表1：
[0057][0058]
由表1可知，实施例2的方法提取得到的精氨酸脱羧酶收率、纯度和酶活都是最高的。说明本发明的方法可以提高精氨酸脱羧酶的收率，降低生产成本。
[0059]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。