一种具有抗肿瘤活性的内皮抑素33肽及其应用

1.本发明涉及一种内皮抑素及其应用，特别涉及一种经过改造的，具有增强抗肿瘤活性的内皮抑素33肽及其应用。本发明属于医药技术领域。


背景技术：

2.内皮抑素(endostatin)最早是由folkman等从小鼠血管内皮细胞中得到，由184个氨基酸残基组成的具有抑制血管生成作用的因子
(1)
。整合素(integrin)是一种介导细胞和其外环境(如细胞外基质，ecm)相互关联的跨膜受体，在肿瘤组织中它们可以充当“双向信号转换器”介导肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用
(2)
。而整合素的这种作用在肿瘤的生长、浸润、转移中发挥了重要作用
(3，4)
。整合素发挥其生物学作用，依赖于一段蛋白序列，此蛋白序列作为整合素和其配体相互作用的识别位点，介导细胞与ecm及细胞间的粘附作用，同时具有信号传导功能。该段蛋白序列为rgd序列(精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸)，很多存在于细胞外基质和血液中的粘附蛋白都包含rgd序列。能够被rgd序列识别并结合的整合素亚型包括αvβ3、α5β1、αvβ1、αⅱb
β3、αvβ5、αvβ6等
(5，6)
，还有一些整合素亚型不能被rgd序列识别，包括α6β1、α2β1和α6β
4(7-10)
。
3.而内皮抑素中存在与rgd序列类似结构的序列，因此能与整合素进行结合，抑制整合素在肿瘤组织发挥的作用，从而抑制肿瘤组织的增殖、转移，达到抗肿瘤的效果。然而由于内皮抑素是大分子量蛋白质，存在抗原性强，致敏原反应明显的副作用；并且内皮抑素的分离和纯化困难
(11,12)
；抗肿瘤作用相对较弱等缺点限制了其在实际临床上的使用。
4.为解决内皮抑素使用上的诸多缺陷，现有方案采用将人内皮抑素第25-31位的rgirgad序列诱变为rgdrgd序列，使内皮抑素能通过rgd序列与肿瘤细胞膜上的整合素(整合素αvβ3等)结合，得到了活性更强的诱变型内皮抑素，其对于肿瘤的发生、发展、转移的抑制能力大大增加
(13-15)
。诱变型内皮抑素的抗肿瘤活性是原内皮抑素的6倍。此成果已获得国家发明专利，专利号：zl200410013621.x。之后我们对诱变型内皮抑素进行了进一步的简化，保留其作为抗新生血管生成的活性区的前24位氨基酸，分别在24肽的氨基端和羧基端加上rgdrgd序列合成了两种30肽的内皮抑素，发现30肽内皮抑素在抗肿瘤的活性方面与诱变型内皮抑素相同，而生产及纯化比诱变型内皮抑素更容易，这两种内皮抑素也具有完全的自主知识产权，并获得了国家发明专利(rgdrgd序列在氨基端的内皮抑素30肽授权公告号：cn104530199b；rgdrgd序列在羧基端的30肽内皮抑素授权公告号：cn100427503c)
(16)
，且中试结果揭示30肽内皮抑素对多种肿瘤都有较好的治疗作用，尤其适用于术后肿瘤残留小鼠模型的肿瘤复发和转移的治疗
(17)
。30肽内皮抑素碱基及氨基酸序列如图1。
5.由于前列腺癌的发病率年年上升，现在泌尿系统中的前列腺癌发病率已升至第二位，未来发病率仍有进一步升高的趋势。对于晚期前列腺癌的治疗，现有治疗方式疗效仍不满意。30肽内皮抑素作为广谱抗肿瘤活性药物，对前列腺癌组织有一定的疗效。但是前列腺癌组织高表达α6β1整合素亚型
(18)
，而该亚型为rgd序列无法识别的亚型之一，因此内皮抑素30肽对于治疗存在rgd无法识别的整合素亚型的肿瘤时(尤其是前列腺癌)，30肽内皮抑素
的抗肿瘤效果欠佳。
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1049.


技术实现要素：

25.本发明主要是为解决目前30肽内皮抑素治疗存在rgd序列无法识别的整合素亚型的肿瘤时，疗效欠佳的问题，从而提供了一种可针对高表达α6β1的前列腺癌治疗的，具有增强抗肿瘤活性的内皮抑素33肽。
26.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
27.本发明发明人发现无法被rgd序列识别的整合素亚型α6β1可以与cd151的胞外大环特异性位点qrd序列(谷氨酰胺-精氨酸-天冬氨酸)相连形成稳定的复合物，即qrd序列可以识别整合素亚型α6β1。据此本发明对30肽内皮抑素进行了进一步改造，在30肽的n末端加上qrd序列，合成了同时具有rgdrgd序列及qrd序列的33肽内皮抑素。33肽内皮抑素由3个氨基酸序列片段构成，分别是：构成内皮抑素抗血管生成活性的24肽、rgdrgd序列和qrd序列。我们通过计算机软件模拟33肽内皮抑素的空间结构，发现其3个氨基酸片段在结构上互不影响，据此推测，33肽内皮抑素既具备30肽内皮抑素的广谱抗肿瘤活性等优点，又在30肽内皮抑素基础上增加了对rgd序列无法识别的整合素亚型(例如前列腺癌组织中的α6β1)的识别能力，进一步增强了抗肿瘤活性。对此我们进行了一系列实验以验证33肽内皮抑素的抗肿瘤活性。结果发现，33肽内皮抑素兼具30肽内皮抑素的广谱抗肿瘤活性，又具备对高表达α6β1亚型的前列腺癌组织的特异性抗癌功能。
28.在上述的研究基础上，本发明提出了一种具有抗肿瘤活性的内皮抑素33肽，所述的内皮抑素33肽由构成内皮抑素抗血管生成活性的24肽、rgdrgd序列和qrd序列组成，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
29.编码所述的具有抗肿瘤活性的内皮抑素33肽的多核苷酸也在本发明的保护范围之内。
30.其中，优选的，所述的多核苷酸的核苷酸序列如seq id no.2所示。
31.进一步的，本发明还提出了所述的具有抗肿瘤活性的内皮抑素33肽在制备具有抗肿瘤药物中的应用。
32.其中，优选的，所述的药物为治疗前列腺癌的药物。
33.其中，优选的，所述的前列腺癌为前列腺癌组织高表达α6β1整合素亚型。
34.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
35.本发明提出了一种经过重新改造后获得的具有抗肿瘤活性的内皮抑素33肽，该内皮抑素33肽具有广谱抗肿瘤活性，特别是对高表达α6β1亚型的前列腺癌组织的特异性抗癌功能。本发明的提出解决了目前30肽内皮抑素治疗存在rgd序列无法识别的整合素亚型的肿瘤时疗效欠佳的问题，为前列腺癌的治疗提供了一种新的有效的技术手段。
附图说明
36.图1为内皮抑素30肽序列(24肽 rgdrgd)；
37.图2为33肽及30肽处理的前列腺癌pc-3细胞的存活率；
38.图3为33肽内皮抑素及30肽内皮抑素对前列腺癌22rv-1细胞增殖能力的影响；
39.图4为33肽内皮抑素和30肽对前列腺癌细胞黏附的影响；
40.所有结果均表示:平均值
±
s.d。(*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001)
41.图5为不同浓度33肽内皮抑素及30肽对前列腺癌细胞迁移的影响；
42.所有结果均表示:平均值
±
s.d。(*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001)
43.图6为不同浓度33肽内皮抑素及30肽对前列腺癌细胞侵袭的影响；
44.所有结果均表示:平均值
±
s.d。(*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001)
45.图7为划痕试验结果；
46.图8为33肽内皮抑素对前列腺癌细胞凋亡的影响；
47.图9为小鼠皮下成瘤(c4-2)实验“内皮抑素33肽组(50ug/ml)、内皮抑素30肽组(50ug/ml)、5％葡萄糖生理盐水组”瘤体图片(每组n＝6)；.
48.图10为小鼠皮下成瘤(c4-2)实验“内皮抑素33肽组(50ug/ml)、内皮抑素30肽组(50ug/ml)、5％葡萄糖生理盐水组”肿瘤体积测量结果(每组n＝6)；
49.图11为小鼠皮下成瘤(c4-2)实验“内皮抑素33肽组(50ug/ml)、内皮抑素30肽组(50ug/ml)、5％葡萄糖生理盐水组”瘤体重量测量结果(每组n＝6)。
具体实施方式
50.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
51.实施例133肽内皮抑素的设计及合成
52.本发明发明人发现无法被rgd序列识别的整合素亚型α6β1可以与cd151的胞外大环特异性位点qrd序列(谷氨酰胺-精氨酸-天冬氨酸)相连形成稳定的复合物，即qrd序列可以识别整合素亚型α6β1。据此我们对30肽内皮抑素进行了进一步改造，在30肽的n末端加上qrd序列，合成了同时具有rgdrgd序列及qrd序列的33肽内皮抑素。33肽内皮抑素的氨基酸序列及编码核苷酸序列如seq id no.1以及seq id no.2所示。
53.33肽内皮抑素由3个氨基酸序列片段构成，分别是：构成内皮抑素抗血管生成活性的24肽、rgdrgd序列和qrd序列。我们通过计算机软件模拟33肽的空间结构，发现其3个氨基酸片段在结构上互不影响。
54.33肽内皮抑素兼具30肽内皮抑素的广谱抗肿瘤活性，又具备对高表达α6β1亚型的前列腺癌组织的特异性抗癌功能。
55.实施例233肽内皮抑素对前列腺癌细胞增殖能力的影响
56.1、采用mtt法测定33肽内皮抑素对前列腺癌pc-3细胞增殖能力的影响
57.内皮抑素30肽用作阳性对照。在33肽内皮抑素及30肽的作用下前列腺癌细胞的增殖受到抑制,导致细胞活性降低，且呈浓度依赖性，33肽内皮抑素相比30肽抑制作用更强。p＜0.05，差异具有统计学意义(表1、图2)。
58.表1不同浓度的33肽内皮抑素和30肽对前列腺癌pc-3细胞增殖能力的影响(od，)
[0059][0060]
2、33肽内皮抑素对前列腺癌22rv-1细胞增殖能力的影响
[0061]
配制22rv-1单个细胞悬液，调整细胞密度为1
×
104个/ml，每孔100μl分别加入到四块96孔培养板中(每板留一个孔用作空白对照孔)，置于37℃5％co2的培养箱中培养。待培养24h细胞贴壁后，向各孔中分别加入33肽内皮抑素和30肽内皮抑素(浓度分别为0、100、200、400μg/ml，每个浓度设5个复孔)。分别培养24h和48h后弃去加肽培养基，用pbs冲洗三次，每孔加入100μl无血清培养基，10μlwst-1，继续在5％co2的37℃孵箱中培养1h。空白孔调零，用酶标仪(bio-rad)测定各孔光吸收值，选择450nm为测定波长，630nm为参考波长，以肽浓度为横坐标，吸光度值(％)为纵坐标绘制曲线。该实验重复三次。结果如图3。
[0062]
实施例333肽内皮抑素对前列腺癌细胞黏附能力的影响
[0063]
使用matrigel基质胶进行细胞粘附的测定。用100μg/ml及200μg/ml的30肽及33肽干预前列腺癌22rv-1细胞后，与对照组相比，加药组细胞对基质膜的黏附性降低，且33肽组相比30肽组黏附性进一步降低(图4)。p＜0.05，差异具有统计学意义。
[0064]
实施例433肽内皮抑素对前列腺癌细胞迁移及侵袭的影响
[0065]
1、transwell小室实验
[0066]
在transwell小室的聚碳酸酯膜的外表面涂fibronectin 5μg，置超净台内风干。在小室的内表面涂matrigel 5μg使之干燥，形成一个基质屏障层。设立对照组、33肽内皮抑素组及30肽内皮抑素组，其中对照组细胞未经肽处理，33肽内皮抑素组及30肽内皮抑素组细胞分别经100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的33肽内皮抑素和30肽内皮抑素处理24h。用胰酶消化细胞，无血清1640培养液重悬细胞。将细胞悬液加到transwell小室中，每小室100μl，细胞数均为1
×
105个。在24孔培养板内加入含20％pbs的rpmi1640培养液，每孔500μl。将小室浸于24孔板的条件培养基中，37℃，5％co2培养箱内孵育24h。孵育结束后，吸弃上室中的溶液，用棉签轻轻擦去小室内侧壁未转膜的细胞，用0.1％结晶紫染小室膜20min，晾干，在100倍显微镜下计数侵袭细胞数，拍照保存。每膜计数上下左右中5个不同视野的穿膜细
胞数，计算平均值。每组设3个平行孔。结果如图5、图6。
[0067]
2、划痕实验
[0068]
实验分三组：对照组、33肽内皮抑素组及30肽内皮抑素组。将生长状态良好的22rv-1细胞接种到6孔培养板中，待细胞生长达到饱和密度形成单细胞层后，对照组不予任何处理、33肽内皮抑素组及30肽内皮抑素组分别给予100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml的33肽内皮抑素和30肽内皮抑素处理24h后，除去培养液，用无菌的塑料加样器在单层细胞上刮去一条无细胞的痕迹，pbs冲洗掉刮起的细胞，再使用无血清培养液培养48h后，在0h、24h和48h分别观察划痕愈合情况，在倒置显微镜下照相。每组设3个平行对照。结果如图7。
[0069]
实施例533肽内皮抑素对前列腺癌细胞凋亡的影响
[0070]
实验分三组：对照组、33肽内皮抑素组及30肽内皮抑素组。将生长状态良好的22rv-1细胞接种到6孔培养板进行培养，对照组不予任何处理、33肽内皮抑素组及30肽内皮抑素组分别给予50μg/ml和100μg/ml的33肽内皮抑素和30肽内皮抑素处理24h后，除去培养液，收集细胞及细胞裂解物，使用pbs进行洗涤，加入ac-devd-amc,之后使用uv流式细胞计分析各组的caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度并进行对比。采用ao/eb染色进行细胞凋亡检测，经30肽内皮抑素与33肽处理后的细胞，可出现胞核皱缩、碎裂，染色质浓缩，聚集在核膜边缘，形成染色质边集，并具有时间和浓度依赖性。与30肽相比，33肽诱导细胞凋亡作用更强(p＜0.05)(图8)。
[0071]
实施例633肽内皮抑素对体内肿瘤的影响
[0072]
在麻醉条件对雄性balb/c裸鼠(6-8周)诱导皮下成瘤。具体而言，将小鼠随机分为3组(n＝6/组)，内皮抑素33肽处理组，内皮抑素30肽处理组，对照组。分别在这三组小鼠右腋皮下注射“前列腺癌c4-2细胞(1
×
106/50μl) 内皮抑素33肽(50ug/ml)”,“前列腺癌c4-2细胞(1
×
106/50μl) 内皮抑素30肽(50ug/ml)”,“前列腺癌c4-2细胞(1
×
106/50μl) 5％葡萄糖生理盐水溶液”诱导皮下肿瘤。随访4周，然后分别将三组小鼠的皮下瘤体切下，进行瘤体大小，重量及体积的测量，并进行统计学分析(p《0.05认为统计学差异显著)。
[0073]
结果如图9-11所示。从该结果可以看出，内皮抑素33肽处理后的瘤体大小、肿瘤体积以及瘤体重量均显著低于内皮抑素30肽组、5％葡萄糖生理盐水组(p《0.05)。