一种同时检测水溶性维生素及代谢产物的沉淀剂和方法与流程

1.本发明属于维生素检测技术领域，具体涉及一种同时检测水溶性维生素及代谢产物的方法，还涉及到适用于该方法的沉淀剂。


背景技术：

2.维生素是维持人和动物正常生理功能不可或缺的一类微量有机物质，在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要作用。人体必需维生素可分为两类：水溶性维生素和脂溶性维生素，其中水溶性维生素中又以b族维生素最为重要，b族维生素主要包括硫胺素(vb1)、核黄素(vb2)、烟酰胺、烟酸(vb3)、泛酸(vb5)、吡哆素(vb6)、生物素(vb7)、叶酸(vb9)和钴胺素(vb12)等。它们是协同作用，调节新陈代谢，维持皮肤和肌肉的健康，增进免疫系统和神经系统的功能，促进细胞生长和分裂(包括促进红血球的产生，预防贫血发生)。维生素b缺乏症，是指因缺乏维生素b而导致的症状。常见的有脚气病、口角炎、口腔溃疡等。
3.不同的维生素在体内具有不同的存在形式，甚至大多数时候是由多种形式共存，因此选择具有临床诊断意义的维生素检测标志物十分关键。例如维生素b6，又称吡哆素，包括吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺三种亚型及其磷酸衍生物。但血清中磷酸吡哆醛(pyridoxal 5
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phosphate，plp)是主要的活性形式，占到维生素b6主要代谢物的70％～90％左右，也是氨基酸、糖类和脂类代谢过程中的重要辅酶，参与上百种酶催化反应，是维持神经系统和免疫系统健康所必需的，且在维持血液中同型半胱氨酸正常水平中扮演重要角色。维生素b9，又称叶酸。但血清中的主要形式为5-甲基四氢叶酸(levomefolic acid，5m-thf)。维生素b12，又称钴胺素，其起功能性的状态指标为甲基丙二酸(methylmalonic acid，mma)。因此，对于vb6、vb9和vb12三种维生素，在血清中检测5-磷酸吡哆醛、5-甲基四氢叶酸和甲基丙二酸更具有实际临床意义。
4.水溶性维生素的检测方法有多种，主要有放射免疫法、化学发光法、高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)等。化学发光法虽然可以实现快速和高通量，但是其特异性低，易与自身抗体、特异性抗体发生交叉反应。而且不同品牌试剂对目标化合物的捕获效率可能存在差异，不同平台的检测结果可比性差，对于缺乏及婴幼儿人群，免疫学方法检测经常会出现假阳性或假阴性。高效液相或气相色谱法灵敏度低且需要较长时间的液相分离无法实现高通量，难以为常规临床检验所用。而液相色谱-串联质谱技术以其样品量小，快速、高灵敏度、高特异性及可以同时检测多种化合物等优点逐渐被临床检验的专家所关注。质谱是一种测量离子质荷比(质量-电荷比)的分析方法。在欧美国家，质谱技术作为医学行业协会公认的生物样本内小分子分析的金标准方法，已被国外权威检测机构包括mayo clinic，quest diagnotics，labcorp等广泛应用于临床研究及诊断。
5.使用lc-ms/ms同时测定多种水溶性维生素的方法已见报道，但由于部分水溶性维生素活性代谢产物(包括5-磷酸吡哆醛、5-甲基四氢叶酸和甲基丙二酸)的特殊性，很难将这几种物质与其它水溶性化合物一起合并检测。在对于它们各自的检测报道中，5-磷酸吡哆醛需要酸沉淀的方法，而甲基丙二酸却需要单独衍生的方法，5-甲基四氢叶酸这个化合
14000rpm、4℃的条件进行离心，取上清液；
22.步骤s4，向步骤s3中获得的每一份上清液中添加naoh调节ph，使ph值在2.2-2.8的范围内，将调节ph值后的上清液使用1000-1500rpm、4℃的条件进行瞬时离心，离心后作为上机样本；
23.步骤s5，取步骤s4中的上机样本进行lc-ms/ms分析。
24.根据以上方案，所述的液相色谱的条件如下：
25.流动相：a相：含0.2％甲酸、2mm甲酸铵的水溶液；b相：含0.2％甲酸、2mm甲酸铵的甲醇溶液；
26.洗脱梯度：
27.时间(min)流速(ml/min)流动相a(％)流动相b(％)0.000.3010002.000.3010004.000.3050505.500.3010906.500.3010907.000.3010008.500.301000
28.柱温：40℃。
29.根据以上方案，所述的质谱采用正负离子同时扫描的方法，离子源参数如下：
30.正离子，离子源：电喷雾正离子源(esi)；检测方式：多反应监测(mrm)；离子源温度(tem)：400℃；雾化气(gas1)：55psi；辅助气(gas2):55psi；气帘气(gurtain gas):35psi；电喷雾电压：5500v；
31.负离子，离子源：电喷雾负离子源(esi)；检测方式：多反应监测(mrm)；离子源温度(tem)：400℃；雾化气(gas1)：55psi；辅助气(gas2):55psi；气帘气(gurtain gas)：35psi；电喷雾电压：-4500v。
32.本发明的有益效果是：实现将这三种活性代谢产物与其它水溶性维生素一起合并检测的方法，并且无需借助复杂的固相萃取小柱或者衍生方法，不仅能够降低检测成本，而且降低了实验人员的操作难度。
附图说明
33.图1是vb1的标准曲线图。
34.图2是vb2的标准曲线图。
35.图3是vb3(nicotinamide)的标准曲线图。
36.图4是vb5的标准曲线图。
37.图5是vb6(plp)的标准曲线图。
38.图6是vb7的标准曲线图。
39.图7是vb9(5m-thf)的标准曲线图。
40.图8是vb12(mma)的标准曲线图。
41.图9是vb1的lloq(0.05ng/ml)色谱图及内标vb1-13c4的色谱图。
42.图10是vb2的lloq(0.25ng/ml)色谱图及内标vb2-13c4,15n2的色谱图。
43.图11是vb3(nicotinamide)的lloq(5ng/ml)色谱图及内标vb3-13c6的色谱图。
44.图12是vb5的lloq(2.5ng/ml)色谱图及内标vb5-13c6,15n2的色谱图。
45.图13是vb6(plp)的lloq(5ng/ml)色谱图及内标vb6-d3的色谱图。
46.图14是vb7的lloq(0.05ng/ml)色谱图及内标vb7-d4的色谱图。
47.图15是vb9(5m-thf)的lloq(0.5ng/ml)色谱图及内标vb9-d3的色谱图。
48.图16是vb12(mma)的lloq(10ng/ml)色谱图及内标vb12-d3的色谱图。
49.以上附图均为lc-ms/ms检测分析结果图，为实施例中的结果展示，图中文字均为结果展示，会根据每一次检测分析的结果发生变化，即图中文字与能否重复实施本发明提供的检测方法无关，图中文字不清晰不影响本领域技术人员重复实施本发明提供的检测方法。
具体实施方式
50.下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行说明。
51.实施例一：一种同时检测水溶性维生素及代谢产物的沉淀剂。
52.一种同时检测水溶性维生素及代谢产物的沉淀剂，其由终浓度为7％的三氯乙酸、0.2m的硫酸锌和3％的维生素c和水组成。
53.配制20ml沉淀剂的过程：称取1.15g znso4*7h2o、1.40g tca以及0.6g vc，用20ml超纯水涡旋溶解，放于棕色玻璃瓶中，在4℃冰箱保存。
54.实施例二：一种同时检测水溶性维生素及代谢产物的方法。
55.一种同时检测水溶性维生素及代谢产物的方法，其在样本前置处理过程中，往样本中添加实施例一所述的沉淀剂，进行沉淀，并通过液相色谱-串联质谱对样本中的水溶性维生素及代谢产物同时进行检测；液相色谱-串联质谱的上机样本的ph值范围是2.2-2.8；液相色谱-串联质谱的流动相a和流动相b中都添加有0.2％甲酸和2mm甲酸铵。
56.检测前处理所涉及的试剂溶液的配制过程如下：
57.7％tca(含0.2m znso4及3％vc)沉淀剂配制：称取1.15g znso4*7h2o、1.40g tca以及0.6gvc，用20ml超纯水涡旋溶解，放于棕色玻璃瓶中，在4℃冰箱保存。
58.2m naoh溶液配制：称取4g naoh溶于50ml水中，室温保存。
59.去维生素血清准备：
60.称取20g活性炭，经超纯水淋洗两次后，加入20ml购买的空白人血清基质，37℃下震摇过夜。过夜后，将其分装到2ml ep管中，13000rpm离心30min，取出上清重复上述离心步骤，将离心好的上清取出合并即得去维生素血清。
61.一种同时检测水溶性维生素及代谢产物的方法包括以下详细步骤：
62.步骤s1，配制系列浓度的校准品(标准品)溶液、质控品溶液和内标工作液：
63.步骤s11,准确称量各水溶性维生素的标准品，加入甲醇(含1％vc)溶解，再将所有维生素标准品溶液混合在一起，然后用50％甲醇(含1％vc)将混合液稀释配制为系列工作液，系列浓度如下：
[0064][0065][0066]
步骤s12：将步骤s11配制的工作液用去维生素血清稀释20倍，配制为最终标准曲线溶液，浓度如下：
[0067]
[0068][0069]
步骤s2，分别取待测样本、校准品溶液和质控品溶液各200μl至1.5ml ep管中，加入内标工作液10μl(内标工作液的维生素浓度与标曲工作液4浓度相同)，涡旋混合15s；
[0070]
步骤s3，往步骤s2中混合好的各样本中加入100μl实施例一中的沉淀剂，并将ep管放于震荡仪上2000rpm条件下震荡5min，将震荡好的样本置于冰上孵化15min，将孵化好的样本置于高速离心机中，12000rpm，4℃条件下离心10min，取上清液；
[0071]
步骤s4，取步骤s3中获得的每一份上清液各150μl置于96孔板中，加入2m naoh调节ph，使ph值在2.2-2.8的范围内，再将96孔板置于震荡仪中，1300rpm震荡2min后，4000rpm4℃条件下离心5min，再取上清液作为上机样本；
[0072]
步骤s5，取步骤s4中的上机样本进行lc-ms/ms分析，采用ab sceix api 4500系统，选择多反应监测mrm扫描模式。
[0073]
作为优选实施例，液相色谱的条件如下：
[0074]
分析柱：waters xselect hss t3，2.1*100mm 2.5μm；
[0075]
进样量：10μl；
[0076]
流动相：a相：含0.2％甲酸、2mm甲酸铵的水溶液；b相：含0.2％甲酸、2mm甲酸铵的甲醇溶液；
[0077]
洗脱梯度：
[0078]
时间(min)流速(ml/min)流动相a(％)流动相b(％)0.000.3010002.000.3010004.000.3050505.500.3010906.500.3010907.000.3010008.500.301000
[0079]
柱温：40℃。
[0080]
作为优选实施例，质谱采用正负离子同时扫描的方法，离子源参数如下：
[0081]
正离子，离子源：电喷雾正离子源；检测方式：多反应监测(mrm)；离子源温度(tem)：400℃；雾化气(gas1)：55psi；辅助气(gas2):55psi；气帘气(gurtain gas):35psi；电喷雾电压：5500v；
[0082]
定性离子、定量离子、碎裂电压和碰撞能量如下(*定量离子)：
[0083][0084][0085]
负离子，离子源：电喷雾负离子源；检测方式：多反应监测(mrm)；离子源温度(tem)：400℃；雾化气(gas1)：55psi；辅助气(gas2):55psi；气帘气(gurtain gas)：35psi；电喷雾电压：-4500v；
[0086]
定性离子、定量离子、碎裂电压和碰撞能量如下(*定量离子)：
[0087]
q1q3dwell timenamedp/vepce/vcxp117.273.120mma-15-10-12-10116.855.120mma-2*-35-12-34-10120.176.120mma-is-10-10-13-10120.158.120mma-is-1*-35-12-34-10
[0088]
采用内标法建立标准曲线，如图1-16所示，结果表明:
[0089]
vb1在0.05-10ng/ml范围内线性关系良好，
[0090]
vb2在0.25-50ng/ml范围内线性关系良好。
[0091]
vb3(nicotinamide)在5-1000ng/ml范围内线性关系良好。
[0092]
vb5在2.5-500ng/ml范围内线性关系良好。
[0093]
vb6(plp)在5-1000ng/ml范围内线性关系良好。
[0094]
vb7在0.05-10ng/ml范围内线性关系良好。
[0095]
vb9(5m-thf)在0.5-100ng/ml范围内线性关系良好。
[0096]
vb12(mma)在10-1000ng/ml范围内线性关系良好。
[0097]
本发明提供的方法性能指标的三天验证，结果如下：
[0098]
[0099][0100]
本发明提供以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。