一种环境响应型主客体自组装树枝状基因载体及其制备方法和应用

1.本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种具有环境响应功能的主客体自组装树枝状基因载体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.癌症的发病机制复杂，其发生、发展、转移、复发的过程均与基因结构和功能的改变密切相关，因此早在几十年前，研究者们就萌生了从基因水平上治疗癌症的设想。1968年，美国学者迈克尔
·
布莱泽首次提出基因治疗的概念。基因治疗是通过将有特定功能的基因传递到靶向组织或细胞中发挥作用、实现治疗效果的方法。有效的基因载体是基因治疗的关键之一。在载体的帮助下，基因的精准输送与控制释放有利于减少治疗的毒副作用并提高疗效。
3.常见的基因载体有病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体虽具有转染效率高的优势，但其高免疫原性成为应用推广的一大隐患。非病毒载体，特别是高分子纳米载体，具有免疫原性低、易于修饰的优点。另外，由于肿瘤部位具有独特的生理结构，血管的内皮细胞间隙大，且缺少淋巴管，可以使一些大分子物质尤其是10-500nm范围内的颗粒更容易穿过血管壁积聚在肿瘤组织中，并能不被淋巴回流带走，从而产生了一种被称为实体瘤的“高渗透和滞留效应”，即epr(enhanced permeability and retention effect)效应的现象。自1986年h
·
maeda在实验中发现epr效应后，高分子纳米载体因自身拥有被动靶向效果，且相比病毒载体安全性强，被广泛用于肿瘤靶向的基因和药物输送。
4.阳离子脂质体能通过静电作用与核酸中负电位的磷酸根结合，将其包裹在脂质体内部，形成稳定的纳米颗粒，保护遗传物质免受降解，是应用最广泛的非病毒基因载体，并被辉瑞公司用于covid-19新冠疫苗的开发中。阳离子聚合物因为制备简单、性质灵活、类型多样、能有效压缩核酸等优点被广泛研究，比较常见的有壳聚糖、聚乙烯亚胺(pei)、聚天冬氨酸(pasp)、聚赖氨酸(pll)、树枝状大分子(dendrimer)等。
5.树枝状大分子是一种具有树状结构的聚合物。它具有精确的分子量、可控的纳米尺寸、规则的三维结构，分子内部空腔可用于装载货物，丰富的末端官能团使其易于进行化学修饰。并且，在生物医药领域中，树枝状大分子的单分散性有利于生物评价结果的重现，其易修饰性有利于模拟蛋白结构，从而避免免疫原性，因此成为良好的用于基因传递的纳米载体。但兼具稳定性强、生物相容性好、有效绑定基因和环境响应等能力的载体需要多个功能基团的引入，因此会存在合成过程繁琐、后处理复杂、多步功能化后总产率低等缺点。


技术实现要素：

6.本发明的第一个目的是提供一种环境响应型主客体自组装树枝状基因载体。克服树枝状大分子用于基因传递的纳米载体时，合成过程繁琐、后处理复杂、多步功能化后总产率低等缺点，可对肿瘤微环境的ph和还原条件进行响应，从而提高基因运载效率。
7.在超分子研究领域，主客体组装技术通过主体基团和客体基团间的非共价作用，驱动形成稳定的主客体结构。这种技术能将功能化模块简便快捷地整合到纳米微粒中，是一种切实有效的材料功能化方法。超分子主体cb[8]因其特定的空腔和端口尺寸，能够容纳带有紫精、萘酚基团的两个芳香客体并通过电荷转移形成稳定的三元组装体。此外，在还原环境中，紫精得到电子之后稳定的三元组装结构会被破坏并自发解组装，这个特性为我们构建环境响应型基因载体提供了基础。
[0008]
本发明的环境响应型主客体自组装树枝状基因载体为主客体自组装结构，主体为cb[8]，自组装过程及产物的模型图如图15所示；
[0009]
其中，客体1结构为萘酚基团与三代树枝状单元相连，氨基为末端官能团，结构式为：
[0010][0011]
客体2结构为紫精基团(联吡啶)通过酰胺键或腙键与聚乙二醇(peg)相连，结构式为：
[0012][0013]
本发明的第二个目的是提供一种环境响应型主客体自组装树枝状基因载体的制备方法，其特征在于：主体和客体在水中形成自组装体，其步骤包括：
[0014]
按照自组装进行的摩尔比称取相应质量的主体cb[8]、客体1和壳体2，将主体[8]加入纯水中并超声溶解；将一种客体溶于水并滴加入主体水溶液；将另一种客体的水溶液滴加入复合物的水溶液中，待数小时后形成自组装体后用相应截留分子量的透析袋在纯水
中透析。优选地，按照1:1:1的摩尔比称取客体1，客体2和cb[8]三种化合物，将cb[8]加入纯水中，超声溶解；将客体2溶于水中，滴加入cb[8]的水溶液，超声后静置；将客体1的水溶液滴加入cb[8]和客体2复合物的水溶液中，静置数小时后用截留分子量为5000的透析袋在纯水中透析；冷冻干燥并收集产物，即为主客体自组装体。
[0015]
进一步地，客体1的制备流程：
[0016][0017]
优选地：化合物1.5制备化合物1.6的方法：以甲醇作溶剂，先加入硝基物质的量的2-5倍的六水合氯化镍，再在冰浴条件下下分批加入硝基物质的量的5-10倍的硼氢化钠，冰
浴数分钟后常温反应数小时，直到点板确定反应停止；
[0018]
化合物2.1制备化合物2.2的方法：以甲酸作溶剂，油浴加热数小时后，多次用甲醇溶解并旋蒸以带走残留甲酸；
[0019]
酰胺化反应合成化合物1.5、1.7、1.9的方法：将带有羧酸基团的化合物溶解，加入羧酸基团物质的量的1-2倍的1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(hoat),加入三乙胺调节ph至8-9，搅拌数分钟后加入羧酸基团物质的量的1-1.2倍的氨基基团化合物，搅拌后在冰浴条件下分批加入羧酸基团物质的量的2-3倍的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci)，冰浴数分钟后常温反应数小时，直到点板确定反应停止。
[0020]
化合物2.3制备化合物2.4的方法：用二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液作溶剂和和脱boc试剂，常温反应24-72小时后完全脱除。
[0021]
进一步优选地，所述客体1的制备步骤如下：
[0022]
将硝基甲烷溶于四氢呋喃中，滴加少量苄基三甲基氢氧化铵(triton-b)后油浴加热，回流，加入硝基甲烷物质的量的3倍的丙烯酸叔丁酯，反应结束后旋转蒸发除去四氢呋喃；二氯甲烷将其溶解后用盐酸、饱和氯化钠溶液分别洗涤1-2次，旋转蒸发；用95％的乙醇溶液重结晶，抽滤后析出白色固体，烘干得到化合物1.2。
[0023]
化合物1.2溶于甲醇，加入化合物1.2物质的量的1倍的六水合氯化镍，冰浴加入化合物1.2物质的量的5倍的硼氢化钠，0℃反应15min，室温下反应3h。用盐酸终止反应，用饱和碳酸氢钠溶液调节ph，旋蒸除去溶剂甲醇，用乙酸乙酯(ea)萃取，饱和氯化钠溶液洗涤3次，旋蒸、烘干，得到化合物1.3。
[0024]
化合物1.3溶于96％甲酸溶液中，反应12h后旋蒸除去甲酸，再用甲醇多次溶解、旋蒸，烘干得到化合物1.4。
[0025]
化合物1.4溶于二氯甲烷中，加入化合物1.4物质的量的3.3倍的hoat、化合物1.4物质的量的10倍的三乙胺后常温密闭搅拌15min，加入化合物1.4物质的量的3.3倍的n-boc-乙二胺，冰浴加入化合物1.4物质的量的6倍的edci，0℃反应0.5h，常温反应3h。结束后用饱和氯化钠溶液萃取，有机相依次被盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。旋蒸、真空干燥，得到化合物1.5。
[0026]
化合物1.5溶于甲醇，加入化合物1.5物质的量的1倍的六水合氯化镍，冰浴加入化合物1.5物质的量的5倍的硼氢化钠，0℃反应15min，室温下反应3h。用盐酸终止反应，用饱和碳酸氢钠溶液调节ph，旋蒸除去溶剂甲醇，用ea萃取，饱和氯化钠溶液洗涤3次，旋蒸除去ea，ea和石油醚混合溶液作淋洗剂柱层析分离，旋蒸、烘干得到化合物1.6。
[0027]
化合物1.4溶于二氯甲烷中，加入化合物1.6物质的量的3.6倍的hoat、化合物1.6物质的量的10倍的三乙胺后常温密闭搅拌15min，加入化合物1.4物质的量的3.3倍的化合物1.3，冰浴加入化合物1.4物质的量的6倍的edci，0℃反应0.5h，常温反应3h。结束后用饱和氯化钠溶液萃取，有机相依次被盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。旋蒸、真空干燥，得到化合物1.7。
[0028]
化合物1.7溶于96％甲酸溶液中，油浴加热，反应36h后旋蒸除去甲酸，再用甲醇多次溶解、旋蒸，烘干得到化合物1.8。
[0029]
化合物1.8溶于无水n-n二甲基甲酰胺(dmf)中，加入化合物1.8物质的量的12倍的hoat、化合物1.6物质的量的40倍的三乙胺后常温密闭搅拌15min，加入化合物1.8物质的量
的12倍的化合物1.6，冰浴加入化合物1.8物质的量的24倍的edci，0℃反应0.5h，常温反应48h。结束后用合适截留分子量的透析袋分别在纯水、甲醇中透析。旋蒸、真空干燥，得到化合物1.9。
[0030]
化合物1.9溶于甲醇，加入化合物1.9物质的量的10倍的六水合氯化镍，冰浴加入化合物1.9物质的量的20倍的硼氢化钠，0℃反应15min，室温下反应12h。用盐酸终止反应，用饱和碳酸氢钠溶液调节ph，旋蒸除去溶剂甲醇，用ea萃取，饱和氯化钠溶液洗涤3次，旋蒸除去ea，二氯甲烷和石油醚混合溶液作淋洗剂柱层析分离，旋蒸、烘干得到化合物1.10。
[0031]
将2-羟基萘和1.4倍物质的量的碳酸钾溶于dmf中，油浴加热至60℃。加入2-羟基萘10倍物质的量的11-溴代十一烷酸甲酯，反应24h。用盐酸溶液终止反应，用ea萃取3次，再用饱和氯化钠溶液洗涤1次，旋转蒸发，石油醚和ea混合溶液作淋洗剂柱层析分离，旋蒸、烘干得到化合物2.1。
[0032]
将化合物2.1溶于四氢呋喃中，3倍物质的量的氢氧化钠固体溶于纯水中。将两种溶液混匀，常温反应3h。旋转蒸发除去四氢呋喃，用盐酸溶液调节ph至3,用ea萃取反应液3次,用饱和氯化钠溶液洗涤，旋蒸、真空干燥，得到化合物2.2。
[0033]
将化合物2.2溶解于无水dmso中,加入6倍物质的量的三乙胺，冰浴加入1倍物质的量的n,n-羰基二咪唑(cdi)，搅拌过夜。加入化合物2.2物质的量的0.5倍的化合物1.10，反应24h。用相应截留分子量的透析袋分别在在纯水、ea中透析，旋蒸、真空干燥，得到化合物2.3。
[0034]
将化合物2.3溶于二氯甲烷中,冰浴滴加等体积三氟乙酸，常温搅拌36h。旋蒸，用氢氧化钠溶液调节ph为9-10，后用相应截留分子量透析袋将溶液于纯水中透析，冷冻干燥得化合物2.4。
[0035]
进一步地，客体2也即化合物3.3的制备流程
[0036][0037]
由化合物3.2制备化合物3.3的方法中采用4-二甲胺基吡啶(dmap)作催化剂，用二甲基亚砜(dmso)作反应溶剂。
[0038]
进一步优选地，所述客体2的制备步骤如下：
[0039]
将联吡啶和1.3倍物质的量的碘甲烷溶解于二氯甲烷中，40℃回流2h。冷却至室温，过滤，用ea多次洗涤，用甲醇重结晶，抽滤，烘干得到化合物3.1。
[0040]
将化合物3.1和5倍物质的量的11-溴代十一酸溶于乙腈，95℃回流24h，过滤后收取沉淀，用甲苯洗涤沉淀数次，烘干得化合物3.2。
[0041]
将mpeg-ald溶于无水乙醇中，密闭并充氮气保护，加入5倍物质的量的2-肼基乙醇，35℃避光反应48h。旋蒸除去乙醇，用冷无水乙醚沉淀3次，得到中间产物mpeg-hyd-oh。
将化合物3.2溶于无水dmso中，加入化合物3.2物质的量的7倍的edci和1.4倍的三乙胺，搅拌30min后加入化合物3.2物质的量的1.4倍的dmap，室温下避光活化30min，加入将化合物3.2物质的量的0.7倍的mpeg-hyd-oh，常温避光反应24h。反应结束后，用相应截留分子量的透析袋在纯水中透析，冷冻干燥得到化合物3.3。
[0042]
本发明还提供了所述环境响应型主客体自组装树枝状基因载体在制备环境响应树枝状基因载体材料中的应用并进而在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
[0043]
本发明制备的环境响应型主客体自组装树枝状基因载体具有以下优点及有益效果：
[0044]
(1)本发明所用的客体化合物，其合成过程中，后处理多为萃取和透析，操作简单，产率高；
[0045]
(2)本发明的环境响应型主客体自组装树枝状基因载体，具有还原环境解组装能力；当peg与联吡啶通过腙键连接，具有ph响应能力。
[0046]
(3)本发明的环境响应型主客体自组装树枝状基因载体，可以通过环境响应有效运输基因；具有高效低毒性的优点。
[0047]
(4)主客体自组装技术简化合成步骤，将多种功能基团通过一个步骤整合到一起。
附图说明
[0048]
图1为化合物1.5的1h-nmr。
[0049]
图2为化合物1.6的1h-nmr。
[0050]
图3为化合物1.7的1h-nmr。
[0051]
图4为化合物1.8的1h-nmr。
[0052]
图5为化合物1.9的1h-nmr。
[0053]
图6为化合物1.10的1h-nmr。
[0054]
图7为化合物2.2的1h-nmr。
[0055]
图8为化合物2.3的1h-nmr。
[0056]
图9为化合物3.2的1h-nmr。
[0057]
图10为化合物3.3的1h-nmr。
[0058]
图11为自组装体1h nmr及其与单独客体的1h nmr对比。
[0059]
图12为自组装体的琼脂糖凝胶电泳结果，其中1为自组装体阻滞质粒dna，2为酸性条件下自组装体阻滞质粒dna，3为还原条件下自组装体阻滞质粒dna，4为自组装体阻滞sirna，5为酸性条件下自组装体阻滞sirna，6为还原条件下自组装体阻滞sirna。
[0060]
图13为自组装体携带sigapdh在hek293和b16f10上的基因沉默效率结果，其中1为pbs组，2为自组装体纯材料组，3为sigapdh组，4为腙键连接peg的自组装体携带sigapdh组，5为酰胺键连接peg的自组装体携带sigapdh组，6为pei 25kd携带sigapdh组。
[0061]
图14为自组装体携带荧光素酶质粒dna(pg-l3)在异种移植b16f10肿瘤的c57/bl6小鼠上的表达结果，其中1为游离pg-l3组，2为腙键连接peg的自组装体携带pg-l3组，3为酰胺键连接peg的自组装体携带pg-l3组，4为pei 25kd携带pg-l3组。
[0062]
图15为本发明的环境响应型主客体自组装树枝状基因载体自组装过程及产物的模型图。
具体实施方式
[0063]
下面，通过实施例对本发明进一步详细阐述。
[0064]
实施例1载体材料的制备
[0065]
(1)客体1
[0066]
称取6.10g(100mmol)硝基甲烷溶解于20ml的四氢呋喃中，再加入1.0ml的triton-b，油浴加热至65-70℃，回流。量取39.7g(310mmol)丙烯酸叔丁酯，缓慢滴加到烧瓶中，保持温度于70-80℃之间,温度低于此范围则补加triton-b(每次0.5-1.0ml)。滴加完毕后，控制温度为70-75℃，反应1h。反应结束后，旋转蒸发除去溶液。足量二氯甲烷溶解，分别用浓度为1mol/l的盐酸溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，再通过旋转蒸发除去二氯甲烷。最后，用95％的乙醇溶液重结晶，抽滤后析出白色固体，于50℃烘干6h即得到白色固体化合物1.2。
[0067]
称取4.456g(10mmol)化合物1.2溶于30ml甲醇中，后称取2.377g(10mmol)六水合氯化镍加入,常温搅拌15min后充分溶解。冰浴分批缓慢加入1.894g(50mmol)硼氢化钠固体，全部加完后0℃反应15min，室温下反应3h。用1mol/l的盐酸溶液终止反应，再用饱和碳酸氢钠溶液调节ph为9-10，旋转蒸发除去溶剂甲醇，剩余液体用ea多次萃取，用饱和氯化钠溶液洗涤ea溶液3次后，通过旋转蒸发除去ea，得到无色油状物质,40℃下真空干燥12h后即得化合物1.3。
[0068]
称取4.456g(10mmol)化合物1.2，用30ml的96％甲酸溶液将其溶解，油浴加热到40℃，反应12h。反应结束后旋转蒸发除去大部分甲酸，得到的固体用甲醇多次溶解，再旋转蒸发除掉甲醇，重复3次以带走残留甲酸，得到白色固体，40℃烘干6h即为化合物1.4。
[0069]
称取277.2mg(10mmol)化合物1.4溶于10ml无水二氯甲烷中，随后向烧瓶中加入449mg(3.3mmol)hoat，缓慢滴加入1.4ml(10mmol)三乙胺后常温密闭搅拌15min，溶液渐渐澄清。量取528.7mg(33mmol)的n-boc-乙二胺，溶于10ml二氯甲烷中，将溶液滴加进烧瓶，然后在0℃条件下缓慢加入1.15g(6.0mmol)edci，保持0℃反应0.5h，再常温反应3h，反应过程中注意保持烧瓶密闭。反应结束，反应液中加入饱和氯化钠溶液进行萃取，有机相依次被1mol/l的盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。旋转蒸发除去溶剂，30℃真空干燥6h后得淡黄色固体化合物1.5，结构由图1的1h-nmr结果确证。
[0070]
称取703.8mg(1.0mmol)化合物1.5，溶于10ml甲醇中，后称取237.7mg(1.0mmol)六水合氯化镍加入烧瓶，常温搅拌15min后充分溶解。冰浴条件下分批缓慢加入189.4mg(5.0mmol)硼氢化钠固体，全部加完后0℃反应15min，再撤去冰浴于室温下反应3h。反应完毕后滴加浓度为1mol/l的盐酸溶液终止反应，再用饱和碳酸氢钠溶液调节ph为9-10，旋转蒸发除去甲醇，剩余液体用ea多次萃取，用饱和氯化钠溶液洗涤ea溶液3次后，旋转蒸发除去ea，得到无色油状物质。加少量硅胶混匀，用ea：石油醚＝1:5的淋洗液过柱，40℃下真空干燥12h后即得化合物1.6，结构由图2的1h-nmr结果确证。
[0071]
取277.2mg(1.0mmol)化合物1.4溶于10ml无水二氯甲烷中，再向烧瓶中依次缓慢加入490.0mg(3.6mmol)hoat，1.4ml(10mmol)三乙胺，常温密闭搅拌15min。称取1.37g(3.3mmol)化合物1.3溶于无水dcm中后滴加进烧瓶，冰浴条件下分批加入1.01g(6.0mmol)edci，全部加完后0℃反应0.5h，再于室温下反应3h，反应过程保持反应器密闭。反应结束后，反应液中加入饱和氯化钠溶液进行萃取，有机相依次被1mol/l的盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。旋转蒸发除去溶剂，后于30℃真空干燥6h，得到白色固体即
为化合物1.7，结构由图3的1h-nmr结果确证。
[0072]
称取1.52g(1.0mmol)化合物1.2，用30ml的96％甲酸溶液将其溶解，油浴加热到45℃，反应36h。反应结束后旋转蒸发除去大部分甲酸，得到的固体用甲醇溶解，旋转蒸发除掉甲醇，重复3次以带走残留甲酸，得到淡黄色固体，40℃真空干燥6h即为化合物1.8，结构由图4的1h-nmr结果确证。
[0073]
称取1013.04mg(1.0mmol)化合物1.8溶于无水dmf中，再依次加入1633.32mg(12mmol)hoat和5.6ml(40mmol)三乙胺，常温密闭搅拌15min。随后将8085.6mg(12mmol)化合物1.6溶于无水dmf，缓慢滴加进烧瓶，在冰浴条件下缓慢加入4600.8mg(24mmol)edci。0℃下反应0.5h，室温下反应48h，反应过程中保持容器密闭。反应结束后，用截留分子量为2000的透析袋在纯水中透析24h，每3h换一次水，再于甲醇中透析2次，旋转蒸发除去甲醇后得到白色固体，于40℃真空干燥12h得到化合物1.9，结构由图5的1h-nmr结果确证。
[0074]
称取614.0mg(0.1mmol)化合物1.9，237.7mg(1.0mmol)六水合氯化镍溶于10ml甲醇中，常温搅拌15min。随后，在0℃下分批缓慢加入75.66mg(2.0mmol)硼氢化钠固体，0℃反应0.5h，室温下反应12h。滴加浓度为1mol/l的盐酸溶液终止反应，再用饱和碳酸氢钠溶液调节ph为9-10，旋转蒸发除去甲醇，剩余液体用ea多次萃取，用饱和氯化钠溶液洗涤ea溶液3次后，旋转蒸发除去ea，得到无色油状物质,加少量硅胶混匀，用二氯甲烷：石油醚＝2:1的淋洗液过柱，40℃下真空干燥12h即可得化合物白色固体化合物1.10，结构由图6的1h-nmr结果确证。
[0075]
称取288.4mg(2.0mmol)2-羟基萘和387mg(2.8mmol)碳酸钾，溶于10ml dmf中，油浴加热至60℃。再用注射器吸取650μl(2mmol)的11-溴代十一烷酸甲酯，加入圆底烧瓶，反应24h。加入浓度为1mol/l的盐酸溶液来终止反应，用ea萃取反应液三次，再用饱和氯化钠溶液洗涤一次，旋转蒸发除掉ea。在剩余化合物中加少量硅胶混匀，用石油醚：ea＝5:1的淋洗液过柱，旋转蒸发再于40℃真空干燥12h后即可得到土黄色固体化合物2.1。
[0076]
称取684.8mg(2.0mmol)化合物2.1溶于15ml四氢呋喃中，称取230mg氢氧化钠固体溶于15ml纯水中。将两种溶液混匀，常温反应3h，直至溶液澄清。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，用浓度为1mol/l的盐酸溶液调节ph至3,后用ea萃取反应液三次,用饱和氯化钠洗涤ea溶液一次，旋转蒸发除去ea，将固体于40℃真空干燥6h得到化合物2.2，结构由图7的1h-nmr结果确证。
[0077]
称取65.69mg(0.2mmol)化合物2.2溶解于无水dmso中,并缓慢滴加入1.2ml三乙胺；称取32.43mg cdi(0.2mmol)溶于无水dmso中，0℃下将cdi的dmso溶液滴加进2.2的dmso溶液中，搅拌过夜。称取610.845mg(0.1mmol)化合物1.10溶于无水dmso,滴加进烧瓶，反应24h后停止。反应液用截留分子量为2000的透析袋在纯水中透析24h,再于ea中透析，旋转蒸发除去ea，于40℃真空干燥6h得到白色固体化合物2.3，结构由图8的1h-nmr结果确证。
[0078]
称取712.2mg(0.01mmol)化合物2.3溶于10ml dcm中,0℃条件下滴加10ml tfa，常温搅拌36h。反应结束后旋转蒸发除去溶剂，用浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph为9-10，后用截留分子量为2000的透析袋将溶液于纯水中透析24h，3h换一次水，冷冻干燥24h得化合物2.4。
[0079]
(2)客体2
[0080]
取1568mg(10mmol)联吡啶、1846mg(13mmol)碘甲烷，溶解于二氯甲烷中，油浴加热
到40℃，回流2h。反应结束后，冷却至室温，过滤，用ea多次洗涤，收取固体。后用甲醇将所得固体重结晶，抽滤，45℃烘干6h即可得到黄色粉末状化合物3.1。
[0081]
取298.1mg(1.0mmol)化合物3.1、1326mg(5mmol)11-溴代十一酸，并将其溶于30ml乙腈，油浴加热到95℃，回流24h，出现大量橙色沉淀。过滤后收取沉淀，用甲苯洗涤沉淀数次，50℃烘干12h得化合物3.2，结构由图9的1h-nmr结果确证。
[0082]
称取400mg(0.2mmol)mpeg-ald，并将其溶于无水乙醇中，密闭并充氮气保护；称取76.1mg(1.0mmol)2-heh溶于678μl无水乙醇，滴加进烧瓶中，加热至35℃避光反应48h。反应结束后旋转蒸发除去乙醇，用冷无水乙醚沉淀3次，得到中间产物mpeg-hyd-oh。圆底烧瓶中加入搅拌子，称取39.4mg(0.07mmol)化合物3.2溶于无水dmso中；将95.8mg(0.5mmol)edci和0.1ml三乙胺溶解于无水dmso中，搅拌30min后滴加入3.2溶液，再加入12.2mg(0.1mmol)dmap，室温下避光活化30min。活化完成后，调整ph至8以上；将103.7mg(0.05mmol)mpeg-hyd-oh溶于无水dmso，滴加进烧瓶，常温避光反应24h。反应结束后，用截留分子量为2000的透析袋在纯水中透析24h，每3h换一次，透析结束后冷冻干燥得到化合物3.3，结构由图10的1h-nmr结果确证。
[0083]
(3)自组装体
[0084]
按照1:1:1的摩尔比称取三种化合物，将cb[8]加入纯水中，超声30min溶解；将客体2溶于水中，滴加入cb[8]的水溶液，超声30min后静置6h；将客体1的水溶液滴加入cb[8]和vp复合物的水溶液中，静置6h后用截留分子量为5000的透析袋在纯水中透析24h,每3h换一次水，最后冷冻干燥24h并收集产物。
[0085]
实施例2化合物的结构确认
[0086]
文中化合物均通过1h nmr确认结构，分子量为400-1000的化合物取5-10mg，分子量超过1000的取10-20mg，将化合物溶于0.5ml氘代溶剂并装入核磁管中，封口后于22℃测试。图10证明客体成功制备，自组装过程成功发生。
[0087]
实施例3化合物的还原和ph响应
[0088]
自组装体在pbs条件、酸处理过(ph＝6.5的pbs)和还原性nas2o5溶液处理的条件下进行其对dna和sirna的凝胶电泳阻滞。图12证明，随着n/p的增大，即随着材料用量增多，每组都表现出dna和sirna从未被绑定到完全绑定并被阻滞的过程。每组材料都能在较小n/p时完全结合基因，说明材料有优秀的结合基因的能力。此外，被ph＝6.5的pbs处理过的自组装体能在更小n/p时完全阻滞dna和sirna，这是因为腙键在酸性条件下断裂，脱去外层的peg，露出材料表面丰富的氨基基团，使其结合带负电基因的能力更强，这验证了dncvp材料的酸响应能力；而被还原性nas2o5溶液处理过的材料则需要较大的n/p时完全阻滞dna和sirna，这是因为自组装体在还原环境中会发生解组装，结构发生变化后其结合基因的能力也受到影响，此结果验证了dncvp材料的还原响应能力。
[0089]
实施例4化合物的载基因能力
[0090]
采用hek 293细胞和b16f10细胞进行基因沉默实验，经过不同处理后用免疫印迹法对蛋白表达结果进行拍摄，再灰度分析，得到定量的蛋白表达结果。图13证明，带有腙键的自组装体效果最好，说明该材料具有良好的基因递送能力；酰胺键连接peg的自组装体组表现较腙键的自组装体差，说明酰胺键相比腙键更加稳定，peg不容易脱落，说明有腙键的自组装体具有ph响应能力。
[0091]
异种移植b16f10肿瘤的c57/bl6小鼠上尾静脉注射不同组别的pg-l3研究自组装体的体内基因转染效率。图14证明，游离的pgl3在肿瘤部位几乎没有表达，而腙键连接peg的自组装体组在肿瘤部位的表达最强，其荧光素酶表达分别是酰胺键连接peg自组装体和pei-25k组的9.5和11.6倍，说明该环境响应型自组装树枝状基因载体具有良好的载基因能力。