一种应用非病毒方法制备高纯度嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法及其应用与流程

一种应用非病毒方法制备高纯度嵌合抗原受体修饰的t细胞的方法及其应用
技术领域
1.本发明属于医学生物工程技术领域，具体涉及一种利用非病毒转座子系统和人工抗原呈递细胞制备高纯度嵌合抗原受体修饰的t细胞的方法及其应用。


背景技术：

2.免疫疗法在癌症治疗中展现出了巨大的潜力，被认为是最有希望攻克癌症的方法，其中嵌合抗原受体(car)修饰的免疫细胞是目前的热门研究领域。基于car修饰的t(car-t)细胞的治疗方法是将患者的t细胞重新定向到特定的肿瘤细胞，并摧毁肿瘤细胞的方法。car是一种基因工程融合蛋白，主要由抗原识别区域和胞内信号转导区域组成。目前，car-t在治疗b细胞恶性肿瘤中得到了广泛的研究，其中诺华和凯特的anti-cd19 car-t已经被fda批准用于治疗急性淋巴细胞白血病和大b淋巴细胞癌。越来越多的研究者开始探索car-t在实体肿瘤治疗中的应用前景。
3.由于nkg2d能够识别mic和ulbp家族中8个在癌细胞中明显上调的相关配体，nkg2d car在过去几年中受到了越来越广泛的关注。在mic家族中，由于等位基因的多态性，人类第6号染色体上的mica和micb基因编码大约105个蛋白质变体，这些蛋白质变体都可以被nkg2d受体识别。ulbp家族成员是一类由6号染色体上的raet1基因编码的糖蛋白，目前已经确定了6种功能蛋白ulbp1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5和ulbp6。总体来说，nkg2d配体在正常组织中不广泛表达，但是在恶性转化、病毒感染或dna损伤的细胞中表达水平升高。流行病学研究估计，高达95％的实体肿瘤至少表达一种nkg2d配体。因此，这两种现象暗示可以采用以nkg2d为基础的嵌合抗原受体靶向实体肿瘤。
4.car-t细胞的制备一般包括t细胞分离、活化、car基因转移、细胞扩增和灌装冻存等步骤。其中，car基因转移是最为关键的一步，因此car-t疗法依赖于高效、稳定和安全的基因转移平台。自20世纪七八十年代以来，基因转移技术已经从简单的物理化学实验室方法迅速发展到目前可应用于临床的病毒和非病毒方法。这些方法的最终目标是在没有明显毒性或致癌事件的情况下实现高效的转基因表达。在car-t细胞的制备过程中，常用的基因转移方法包括慢病毒载体方法和逆转录病毒载体方法。由于慢病毒载体比逆转录病毒载体具有更加安全的整合位点，因此常用于构建car-t细胞。利用慢病毒载体制备car-t，其car转基因在终产品中的表达比例为40％～60％。nkg2d car-t目前的制备方法主要也是通过慢病毒载体将nkg2d car的编码基因转移至t细胞中。然而，由于病毒载体本身具有致病原性和插入突变的潜力，对人类临床试验的实施构成了重大的监管障碍。不仅如此，在细胞系中大规模制造病毒载体存在成本高、效率低的问题，对car-t的临床转化构成了障碍，显著提高了car-t的生产成本。
5.为了克服病毒载体系统的上述局限性，研究者进一步探索了非病毒载体的可行性。通常，非病毒载体系统为人工合成系统，不依赖于任何病毒成分或哺乳动物细胞进行生产制造，成本低，同时有利于避免使用病毒载体带来的免疫问题。dna转座子是一种典型的
非病毒载体系统，具有基因可持续性表达、免疫原性低、成本低、效率高等优点。
6.在自然界中，dna转座子是包含转座酶基因的离散dna片段，其两侧是包含转座子结合位点的反向末端重复序列(itrs)。转座的过程为转座酶结合到tirs上，从一个位置“剪切”转座，并“粘贴”到另一个新的位置。基于转座子的载体系统，如睡美人(sb)系统、piggybac(pb)系统、tol转座子系统，是利用转座的方法，将转基因引入到宿主基因组。与逆转录病毒载体类似，稳定的基因组整合到宿主中可以实现长期高效的转基因表达。pb转座子元件首先在甘蓝蠖度尺蛾被发现，后来被证实在其他物种中也具有交叉功能。pb转座酶通过识别转座子载体上的反向末端重复序列(itrs)和基因组中相应的ttaa序列，介导载体和宿主基因组之间的遗传物质交换，因此，由itrs支持的转基因可以稳定地整合到ttaa整合位点。重要的是，pb转座酶可以在切除后将ttaa序列恢复到原来的序列，这允许在需要时移除转基因转座，而不会对宿主基因组产生进一步影响。sb和pb转座子都已成功用于修饰t细胞，使其表达cd19特异性car。然而目前转座子介导的基因转移的局限性是细胞携带转基因的比例低或细胞扩增倍数少，对临床上car-t有效的发挥肿瘤细胞杀伤作用构成了障碍。


技术实现要素：

7.为了克服目前nkg2d car-t生产制备中使用慢病毒造成的监管障碍、生产成本高的问题，或使用转座子系统造成的car-t细胞比例低、car-t细胞扩增效率有限等问题，本发明提供了一种联合使用转座子系统和人工抗原呈递细胞制备高纯度nkg2d嵌合抗原受体基因修饰的t细胞的方法，所述方法包括：
8.(1)利用piggybac(pb)转座子系统将编码nkg2d嵌合抗原受体(car)的基因转入t细胞；
9.(2)利用人工抗原呈递细胞富集扩增nkg2d嵌合抗原受体基因修饰的t细胞。
10.所述t细胞可以来自人的外周血、脐带血或诱导性多能干细胞(ipsc)等。
11.优选地，步骤(1)所述pb转座子系统包括辅助载体和供体载体；所述辅助载体包括cmv启动子和pb转座酶编码基因，由质粒编码；所述供体载体包括pb转座子5’反向末端重复序列(5’itr)和3’反向末端重复序列(3’itr)，在5’itr和3’itr之间设有两个鸡β-珠蛋白染色质绝缘子chs4，在两个绝缘子之间包括ef1α启动子和编码nkg2d car的基因，由质粒编码。
12.优选地，所述pb转座酶的氨基酸序列来自genbank：aaa87375.2；所述pb转座子的5’反向末端重复序列(5’itr)如seq id no:1所示，3’反向末端重复序列(3’itr)如seq id no:2所示，鸡β-珠蛋白染色质绝缘子chs4来自genbank：ay040835.1；
13.seq id no:1：
[0014]5’-
ccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgtgtaaaattgacgcatg-3’；
[0015]
seq id no:2：
[0016]5’-
catgcgtcaattttacgcagactatctttctaggg-3’。
[0017]
所述nkg2d car包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜区和胞内信号转导区，其中抗原结合结构域为nkg2d的胞外区域，nkg2d car可以是一代car、二代car、三代car或四代car。所述一代car结构中常用tcr复合体的cd3ζ胞内段作为胞内信号区；所述二代car结构
中，在原有胞内信号区的基础上串联上一个共刺激信号元件，例如cd28、ox-40和4-1bb等；所述三代car结构中，在原有胞内信号区的基础上串联上两个共刺激信号元件；所述四代car结构中，在三代car的基础上，引入细胞因子和共剌激配体。
[0018]
优选地，所述nkg2d car的抗原结合结构域来自nkg2d(uniprotkb-p26718)的第83～216位氨基酸，铰链区来自igg4(uniprotkb-p01861)的第99～110位氨基酸，跨膜区来自cd28(uniprotkb-p10747)的第153～179位氨基酸，胞内结构域来自4-1bb(uniprotkb-q07011)的第209～255位氨基酸和cd3ζ(uniprotkb-p20963)的第52～164位氨基酸。
[0019]
优选地，所述piggybac转座子系统通过电转的方法转入t细胞中。
[0020]
进一步优选地，将1
×
107个pbmc细胞重悬于100μl lonza p3 primary cell nucleofector solution，加入5μg辅助质粒和10μg供体质粒，混匀并转移至lonza电击杯，经lonza 4d-nucleofector device的eo115程序电转。
[0021]
优选地，在步骤(1)中，所述利用pb转座子系统将编码nkg2d car的基因转入t细胞前，t细胞可以预先被活化，也可以预先不被活化。
[0022]
若t细胞预先被活化，可以采用抗体、抗体包被的微粒或磁珠进行活化；所述抗体包括抗人cd3抗体、抗人cd3抗体/抗人cd28抗体、抗人cd3抗体/抗人cd137抗体或抗人cd3抗体/抗人cd28抗体/抗人cd137抗体中的任意一种或至少两种的组合；所述抗体包被的微粒或磁珠包括抗人cd3抗体包被微粒或磁珠、抗人cd28抗体包被微粒或磁珠、抗人cd137抗体包被微粒或磁珠、抗人cd3/抗人cd28抗体包被微粒或磁珠、抗人cd3/抗人cd137抗体包被微粒或磁珠或抗人cd3/抗人cd28/抗人cd137抗体包被微粒或磁珠中的任意一种或至少两种的组合。
[0023]
优选地，在步骤(1)中，若t细胞预先被活化，可在t细胞活化后的第1～7天，例如第1、2、3、4、5、6或7天，利用转座子系统将编码嵌合抗原受体的基因转入t细胞中，得到初始的nkg2d car修饰的t细胞。进一步优选为在t细胞活化后的第2天利用pb转座子系统将编码nkg2d car的基因转入t细胞中。
[0024]
优选地，利用pb转座子系统将编码nkg2d car的基因转入t细胞后的0～10天，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，将初始的nkg2d car修饰的t细胞与人工抗原呈递细胞共培养。
[0025]
优选地，若t细胞未被活化，在利用pb转座子系统将编码nkg2d car的基因转入t细胞后0～2天与人工抗原呈递细胞共培养，进一步优选地，应立即与人工抗原呈递细胞共培养；若t细胞预先被活化，在利用pb转座子系统将编码嵌合抗原受体的基因转入t细胞后的4～6天，再与人工抗原呈递细胞共培养。
[0026]
优选地，步骤(2)所述人工抗原呈递细胞为工程化的人髓系白血病细胞株k562，所述工程化的人髓系白血病细胞株k562表达nkg2d配体、cd64高亲和力fc受体、共刺激分子cd86和cd137l、筛选标志物嘌呤霉素(puromycin)和绿色荧光蛋白egfp。
[0027]
优选地，所述工程化的人髓系白血病细胞株k562表达的cd64为uniprotkb：p12314、cd86为uniprotkb：p42081、cd137l为uniprotkb：p41273、egfp的氨基酸序列如seq id no:3所示、puromycin的氨基酸序列如seq id no:4所示；
[0028]
seq id no:3：
[0029]
mvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkley
nynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk；
[0030]
seq id no:4：
[0031]
mteykptvrlatrddvpravrtlaaafadypatrhtvdpdrhiervtelqelfltrvgldigkvwvaddgaavavwttpesveagavfaeigprmaelsgsrlaaqqqmegllaphrpkepawflatvgvspdhqgkglgsavvlpgveaaeragvpafletsaprnlpfyerlgftvtadvevpegprtwcmtrkpga。
[0032]
优选地，所述人工抗原呈递细胞可以是经过γ射线处理的，γ射线处理采用本领域的常规方式进行，例如采用100gyγ射线辐射细胞；也可以是经过丝裂霉素c处理的，例如采用20μg/ml丝裂霉素c于37℃细胞培养箱处理饲养细胞2小时。
[0033]
优选地，在步骤(2)中，所述nkg2d car修饰的t细胞与人工抗原呈递细胞共培养的比例为1:(0.1～10)，例如可以是1:0.1、1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选为1:1或1:2。
[0034]
优选地，在步骤(2)中，每一轮nkg2d car修饰的t细胞与人工抗原呈递细胞共培养的周期为3～14天，例如可以是3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天，优选为6～10天。
[0035]
优选地，在步骤(2)中，nkg2d car修饰的t细胞与人工抗原呈递细胞共培养可重复多次，优选为1～10轮。
[0036]
本发明中，nkg2d car修饰的t细胞培养通常采用液体培养基进行，所述液体培养基包括本领域常用的细胞培养基，例如可以是aim v
tm
(gibco)、x-vivo
tm 15(lonza)、scgm
tm
(cellgenix)、rpmi、texmacs
tm
(miltenyi)、optmizer
tm
(gibco)或stemspan
tm
(stemcell)。
[0037]
本发明中，nkg2d car修饰的t细胞在培养过程中存在细胞因子，并且每48～72小时，按全液体积添加细胞因子，所述细胞因子包括hril-2、hril-7、hril-12、hril-15或hril-21中的任意一种或至少两种的组合，优选为hril-2或hril-7和hril-15的组合。
[0038]
优选地，所述hril-2的终浓度为50～300iu/ml，例如可以是50iu/ml、100iu/ml、150iu/ml、200iu/ml、250iu/ml或300iu/ml，优选为100～300iu/ml。
[0039]
优选地，所述hril-7和hril-15的终浓度为1～100ng/ml，例如可以是1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml，优选为5～20ng/ml。
[0040]
作为优选技术方案，本发明提供了一种联合使用转座子系统和人工抗原呈递细胞制备高纯度嵌合抗原受体基因修饰的t细胞的方法，所述方法包括：
[0041]
(1)将分离的外周血单个核细胞(pbmc)经100ng/ml okt3进行活化，2天后，利用lonza 4d-nucleofector device，将pb转座子系统的辅助质粒和编码nkg2d car的供体质粒电转至t细胞中；
[0042]
(2)电转5天后，将car-t细胞与经γ射线处理的工程化的k562 aapc按1:2的比例共培养7天；
[0043]
(3)将步骤(2)得到的nkg2d car修饰的t细胞继续与经γ射线处理的工程化的k562 aapc按1:2的比例共培养7天，此步骤可多次重复。
[0044]
其中，所述细胞培养液为添加有1～5％人ab血清/人自体血浆的aim v培养液，在培养过程中存在il-2，il-2的终浓度为50～300iu/ml。
[0045]
作为优选技术方案，本发明还提供了一种联合使用转座子系统和人工抗原呈递细胞制备高纯度嵌合抗原受体基因修饰的t细胞的方法，所述方法包括：
[0046]
(1)将分离的外周血单个核细胞(pbmc)应用pb转座子系统进行转基因，利用lonza 4d-nucleofector device或其他电转仪将编码pb转座子系统的辅助质粒和编码nkg2d car的供体质粒电转至t细胞中；
[0047]
(2)电转后，立刻将car-t与经γ射线处理的工程化的k562 aapc按1:2的比例进行共培养10天；
[0048]
(3)将步骤(2)得到的nkg2d car修饰的t细胞继续与经γ射线处理的工程化的k562 aapc按1:2的比例共培养7天，此步骤可多次重复。
[0049]
其中，所述细胞培养液为添加有1～5％人ab血清/人自体血浆的aimv培养液，在培养过程中存在il-2，il-2的终浓度为50～300iu/ml。
[0050]
本发明还提供了采用上述方法制备得到的nkg2d-car-t细胞，以及所述nkg2d-car-t细胞在制备肿瘤治疗和/或预防药物中的应用。
[0051]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0052]
(1)目前car-t细胞的制备中，car基因递送主要依赖于慢病毒或逆转录病毒载体，然而慢病毒的生产过程复杂、成本高，极大地提高了car-t的生产成本，诺华的kymriah被定价为47.5万美元，昂贵的价格使得很多肿瘤病人无法承担；本发明采用非病毒的方法，利用pb转座子系统和人工抗原呈递细胞k562制备、扩增和富集car-t细胞，对于临床生产，系统中的辅助载体和供体载体为gmp级别的质粒即可，人工抗原呈递细胞原可以持续高效地刺激car-t细胞增殖，有利于将car-t细胞富集扩增至90％以上；
[0053]
(2)慢病毒或逆转率病毒载体的使用给操作人员也带来了一定的安全隐患，不仅如此，在使用慢病毒或逆转率病毒载体进行car-t制备的同时，也带来了car-t产品污染复制型逆转录病毒(rcr)或复制型慢病毒(rcl)的潜在风险，虽然随着病毒载体设计及生产体系的不断改进,这种风险已大大降低，但仍不能完全排除；本发明使用的pb转座子系统是一种非病毒的方法，十分安全，不会存在这些隐患；
[0054]
(3)现有制备car-t的方法，需要获得病人大量的淋巴细胞作为起始材料；而本方法利用人工抗原呈递细胞，可以不断地刺激car-t细胞增殖，因此起始只需要抽取患者少量的血液作为起始材料；
[0055]
(4)在本发明提供的高纯度nkg2d car-t细胞的制备方法中，pb转座系统与人工抗原呈递细胞的结合是必须的。本发明一共提出两种制备方案，其中方法二在无需t细胞预先活化的情况下，2周内便可以得到高纯度的car-t细胞，在未做分选的情况下，纯度高达90％以上，而采用慢病毒载体方式制备的car-t细胞的纯度仅50～60％，同时，本发明的方法显著缩短了car-t的生产周期，且材料简单、生产成本低廉、操作简单安全、重复性高；
[0056]
(5)采用本发明的方法制备的nkg2d car-t细胞对肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，同时可以抑制肿瘤细胞生长，在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。
附图说明
[0057]
图1a为质粒1的图谱，图1b为质粒3的图谱，图1c为质粒4的图谱，图1d为质粒5的图谱；
[0058]
图2为k562-t1细胞表面cd64、cd137l和cd86的表达；
[0059]
图3为三步法利用piggybac转座子系统制备nkg2d-car-t的流程图；
[0060]
图4为三步法利用piggybac转座子系统制备的gfp-t细胞在培养第7、14、21、28天时，gfp在细胞群体中所占的比例，横坐标为gfp的荧光表达强度，纵坐标为细胞计数；
[0061]
图5a为cd3在不同培养天数的nkg2d-car-t细胞中的表达比例，纵坐标为cd3在细胞群体中的比例，横坐标为时间，图5b为car在不同培养天数的nkg2d-car-t细胞中的表达比例，纵坐标为car在细胞群体中的比例，横坐标为时间；
[0062]
图6a为nkg2d-car-t细胞在每一轮扩增周期中的细胞总数扩增倍数，纵坐标为细胞总数的扩增倍数，横坐标为时间，图6b为nkg2d-car-t细胞在不同培养天数时的累积的细胞总数扩增倍数，纵坐标为细胞总数的扩增倍数(log2)，横坐标为时间；
[0063]
图7为第28天的nkg2d-car-t细胞的记忆表型，纵坐标为各个记忆表型在细胞群体里的比例，横坐标为不同的细胞记忆表型，分别为central memory、effector memory和effector细胞；
[0064]
图8a为第7天的car-t细胞中car的表达比例，横坐标为car的表达强度，纵坐标为nkg2d的表达强度，图8b为第14天的car-t细胞中car的表达比例，横坐标为car的表达强度，纵坐标为细胞计数，图8c为第21天的car-t细胞中car的表达比例，横坐标为car的表达强度，纵坐标为细胞计数，图8d为第7天的car-t/gfp-t细胞对人结直肠癌细株系hct116的杀伤，图8e为第14天的car-t/gfp-t细胞对人结直肠癌细株系hct116的杀伤，图8f为第21天的car-t细胞对人结直肠癌细株系hct116的杀伤，横坐标为car-t与hct116细胞的效靶比，纵坐标为hct116被杀伤的百分比，其中黑色实线代表car-t的杀伤，黑色虚线代表gfp-t的杀伤；
[0065]
图9为第28天的car-t细胞对人胃癌细胞株mgc-803的实时杀伤，横坐标为肿瘤细胞铺板后(即实验开始后)的时间，以小时计，纵坐标为细胞指数；
[0066]
图10为两步法利用piggybac转座子系统制备nkg2d-car-t的流程图；
[0067]
图11a为cd3在不同培养天数的nkg2d-car-t细胞中的表达比例，纵坐标为cd3在细胞群体中的比例，横坐标为时间，图11b为car在不同培养天数的nkg2d-car-t细胞中的表达比例，纵坐标为car在细胞群体中的比例，横坐标为时间；
[0068]
图12a为nkg2d-car-t细胞在每一轮扩增周期中的细胞总数扩增倍数，纵坐标为细胞总数的扩增倍数，横坐标为时间，图12b为nkg2d-car-t细胞在不同培养天数时的累积的细胞总数扩增倍数，纵坐标为细胞总数的扩增倍数(log2)，横坐标为时间；
[0069]
图13为第14天的nkg2d-car-t细胞的记忆表型，纵坐标为各个记忆表型在细胞群体里的比例，横坐标为不同的细胞记忆表型，分别为central memory、effector memory和effector细胞；
[0070]
图14为第15天的car-t细胞对人卵巢癌细胞株skov3的实时杀伤，横坐标为肿瘤细胞铺板后(即实验开始后)的时间，以小时计，纵坐标为细胞指数；
[0071]
图15为car-t细胞在皮下结直肠癌小鼠模型中的抗肿瘤效果，癌细胞腹腔内注射3天后，car-t细胞静脉注射，第4天和第25天通过生物荧光成像显示的小鼠体内的肿瘤，
×
代表小鼠已经死亡；
[0072]
图16为荷瘤小鼠的存活情况，纵坐标为存活小鼠占每组小鼠总数的百分比，横坐
标为小鼠的存活时间(从肿瘤接种开始算起)；
[0073]
图17为car-t细胞在结直肠癌肺转移小鼠模型中的抗肿瘤效果，癌细胞静脉注射3天后，car-t细胞静脉注射，第3、10、24天通过生物荧光成像显示的小鼠体内的肿瘤；
[0074]
图18为car-t细胞在卵巢癌肺转移小鼠模型中的抗肿瘤效果，癌细胞静脉注射3天后，car-t细胞静脉注射，第3、45天通过生物荧光成像显示的小鼠体内的肿瘤。
具体实施方式
[0075]
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
[0076]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
[0077]
除非特别说明，否则细胞培养在37℃、5％co2、潮化(相对湿度为95％)的条件下。
[0078]
实施例中采用的实验材料和设备如下：
[0079]
人卵巢癌细胞系skov3-luc、人结直肠癌细胞株hct116-luc、人胃癌细胞株mgc-803、野生型人髓系白血病细胞k562购自atcc；
[0080]
skov3-luc和hct116-luc的培养基为mccoy 5a(gibco) 10％fbs(gibco)，mgc-803的培养基为rpmi 1640(gibco) 10％fbs(gibco)，k562的培养基为imdm(gibco) 10％fbs(gibco)；
[0081]
pbmc提取自实体肿瘤患者或健康捐献者的外周血；
[0082]
人重组il-2(hril2)购自北京双鹭公司；
[0083]
抗人cd3抗体okt3购自ebioscience公司；
[0084]
t细胞培养液：aim培养基(gibco) 5％人类ab血清(gemini公司)；
[0085]
p3 primary cell 4d-nucleofector x kit购自lonza公司；
[0086]
pe-结合的抗人cd3抗体、apc-结合的抗人nkg2d抗体购自bd公司，fitc-结合的抗strep-tag ii抗体购自金斯瑞公司，fitc-结合的抗人cd45ra抗体、apc-结合的抗人ccr7抗体、apc-结合的抗人cd64抗体、apc-结合的抗人cd86抗体和apc-结合的抗人cd137l购自biolegend公司；
[0087]
流式细胞仪购自bd公司，型号为c6 sampler；
[0088]
实时杀伤检测仪器购自acea bio，型号为xcelligence rtca dp；
[0089]
nkg2d car为：nkg2d-cd28-4-1bb-cd3ζ，抗原结合结构域来自nkg2d(uniprotkb-p26718)的第83～216位氨基酸、铰链区来自igg4(uniprotkb-p01861)的第99～110位氨基酸、跨膜区来自cd28(uniprotkb-p10747)的第153～179位氨基酸，胞内结构域来自4-1bb(uniprotkb-q07011)的第209～255位氨基酸和cd3ζ(uniprotkb-p20963)的第52～164位氨基酸；
[0090]
egfp的氨基酸序列如seq id no:3所示；puromycin的氨基酸序列如seq id no:4所示。
[0091]
实施例1载体构建
[0092]
(1)构建用于制备人工抗原呈递细胞的aapc载体
[0093]
dna片段1：cmv启动子核苷酸序列、puromycin的编码核苷酸序列、egfp的编码核苷酸序列由外包的服务公司合成，序列两端带有spei和xbai序列；
[0094]
dna片段2：cmv启动子核苷酸序列、cd64的编码核苷酸序列、p2a的编码核苷酸序列、cd137l的编码核苷酸序列、t2a的编码核苷酸序列、cd86的编码核苷酸序列由外包的服务公司合成，序列两端带有spei和avrii序列；
[0095]
将dna片段1和dna片段2通过spei、xbai和avrii酶切后，克隆进pfastbac1质粒(购自thermofisher)，命名为质粒1，如图1a所示。
[0096]
(2)构建nkg2d car载体
[0097]
为了构建nkg2d car载体，将nkg2d的胞外抗原结合结构域(ed)与igg4铰链区、cd28跨膜区、4-1bb和cd3ζ的信号传导结构域融合，生成二代nkg2d car载体；为了便于通过流式细胞术检测car的表达，在car的序列中均加入3个strep-tag ii(st2)重复序列；car片段由外包的服务公司合成，序列的5'端和3'端包括限制性酶切位点ecori和sali；
[0098]
合成的dna片段通过ecori和sali酶切后，克隆进pfastbac1质粒(购自thermofisher)，nkg2d car的载体命名为质粒2。
[0099]
(3)构建piggybac转座子载体(供体载体)
[0100]
将piggybac转座子的5’反向末端重复序列(seq id no:1)、鸡β-珠蛋白染色质绝缘子chs4(genbank：ay040835.1)、ef1α启动子、ecori和sali酶切位点序列、sv40 polya序列、反向互补的chs4序列和3’反向末端重复序列(seq id no:2)融合，并由外包的服务公司合成，通过bsai克隆进pmaxcloning载体(购自lonza公司)，命名为pzts4，融合基因的表达由ef1α启动子控制；
[0101]
为了构建含有nkg2d car基因的转座子供体载体，将质粒2中的car序列通过ecori和sali酶切后克隆进pzts4，命名为质粒3，如图1b所示，car基因的表达由ef1α启动子控制；
[0102]
为了构建含有egfp基因的转座子供体载体，将egfp序列通过ecori和sali克隆进pzts4，命名为质粒4，如图1c所示，egfp基因的表达由ef1α启动子控制。
[0103]
(4)构建piggybac转座酶载体(辅助载体)
[0104]
为了构建piggybac转座酶编码质粒，在piggybac转座酶基因(genbank：ef587698.1)的两端分别添加agei和saci酶切位点，序列由外包的服务公司合成，并通过两个酶切位点克隆进pmaxcloning载体，命名为质粒5，如图1d所示，pmaxcloning载体中的cmv启动子控制piggybac转座酶的表达。
[0105]
实施例2制备人工抗原呈递细胞k562-t1
[0106]
将野生型k562细胞重悬于10ml opti-mem中，300
×
g离心10min，将细胞沉淀重悬于100μl p3buffer中，加入5μg质粒1，混匀后转移至lonza电击杯；
[0107]
将电击杯置于lonza 4d-nucleofectortm x unit(单电击杯模块中)，进行电转，电转结束后，将一个cuvette中的k562细胞悬液缓慢转移至6孔板的一个孔中，孔里预先加入k562培养基(imdm 10％fbs)；
[0108]
电穿孔后的第5天，在200μg/ml浓度下进行为期1个月的puromycin筛选，培养基每2天更换一次；
[0109]
1个月后，使用细胞分选仪bd facsaria(bd biosciences公司)将单细胞分选到96
孔板，对扩增的单细胞克隆进行流式细胞术分析，检测融合基因的表达情况，检测抗体分别为apc-结合的抗人cd64抗体、pe-结合的抗人cd86抗体和apc-结合的抗人4-1bbl抗体，筛选到的单细胞克隆命名为k562-t1。
[0110]
如图2所示，k562-t1细胞表面表达了高水平的cd64、cd137l和cd86，其阳性率都在90％以上。
[0111]
实施例3利用piggybac转座子系统制备nkg2d-car-t(三步法)
[0112]
制备流程图如图3所示：
[0113]
第0天，将1
×
107个pbmc重悬于3ml t细胞培养基，接种于6孔板的一个孔中，加入okt3和hril-2使其终浓度分别为100ng/ml和300iu/ml；
[0114]
第2天，取出悬浮的细胞进行计数，300
×
g离心10min；用10ml opti-mem重悬细胞沉淀，300
×
g离心10min；将细胞沉淀重悬于100μl p3 buffer中，加入5μg质粒5和10μg质粒3，混匀后转移至电lonza电击杯；将电击杯置于lonza 4d-nucleofectortm x unit(单电击杯模块中)，进行电转，电转结束后，将一个cuvette中的t细胞悬液缓慢转移至12孔板的一个孔中，孔里预先加入含有终浓度为300iu/ml的hril-2的2ml t细胞培养液，将12孔板置于37℃细胞培养箱培养；
[0115]
第3天至第7天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有300iu/ml hril-2的t细胞培养液；
[0116]
第7天，收获全部细胞进行计数，取2
×
106个细胞进行流式细胞表型分析(gfp、抗人cd3抗体、抗strep-tag ii抗体、抗人cd45ra和抗人ccr7抗体、抗人nkg2d抗体)；将2
×
106个细胞与4
×
106个k562-t1(实施例2制备，100gyγ射线辐照)重悬于10ml培养基中，加入hril-2使其终浓度300iu/ml；
[0117]
第7天至第14天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有300iu/ml hril-2的t细胞培养液；
[0118]
第14天，收获全部细胞进行计数，取2
×
106个细胞进行流式细胞表型分析(gfp、抗人cd3抗体、抗strep-tag ii抗体、抗人cd45ra和抗人ccr7抗体、抗人nkg2d抗体)；将2
×
106个细胞与4
×
106个k562-t1(实施例2制备，100gyγ射线辐照)重悬于10ml培养基中，加入hril-2使其终浓度300iu/ml；
[0119]
第14天至第21天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有300iu/ml hril-2的t细胞培养液；
[0120]
第21天，收获全部细胞进行计数，取2
×
106个细胞进行流式细胞表型分析(gfp、抗人cd3抗体、抗strep-tag ii抗体、抗人cd45ra和抗人ccr7抗体、抗人nkg2d抗体)；将2
×
106个细胞与4
×
106个k562-t1(实施例2制备，100gyγ射线辐照)重悬于10ml培养基中，加入hril-2使其终浓度300iu/ml；
[0121]
第21天至第28天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有300iu/ml hril-2的t细胞培养液；
[0122]
第28天，收获全部细胞进行计数，取2
×
106个细胞进行流式细胞表型分析(gfp、抗人cd3抗体、抗strep-tag ii抗体、抗人cd45ra和抗人ccr7抗体、抗人nkg2d抗体)。
[0123]
实施例4利用piggybac转座子系统制备gfp-t(三步法)
[0124]
与实施例3相比，将质粒3替换为质粒4，制备gfp-t细胞，并在与k562-t1共培养的
过程中，分别在培养第7、14、21天添加100ng/ml okt3，其他步骤与实施例3相同。
[0125]
在培养第7、14、21、28天的时候取样，通过流式细胞术检测gfp在细胞群体中所占的比例，结果如图4所示，gfp-t在培养第7、14、21、28天时，细胞群体中gfp所占的比例分别为22.1％、46.1％、46.4％、39.9％。
[0126]
实施例5三步法制备的nkg2d-car-t的扩增倍数和细胞表型
[0127]
根据实施例3的方法，采用来自3个捐献者(donor 1、donor 2、donor 3)的pbmc进行nkg2d-car-t细胞的制备，并分别在第7、14、21、28天计数，取样进行流式检测分析，所用抗体组合为(1)pe-结合的抗人cd3抗体，(2)fitc-结合的抗strep tag ii抗体，(3)fitc-结合的抗人cd45ra抗体 apc-结合的抗人ccr7抗体。
[0128]
如图5a所示，在car-t培养第7、14、21、28天，细胞群体中cd3 的细胞比例均在90％以上；如图5b所示，在car-t培养第7至28天，细胞群体中car 的细胞比例从第7天的20％～50％逐渐增加，在第21天时达到90％左右，在第28天时仍然维持在90％水平。
[0129]
如图6a所示，以起始pbmc数量计算，细胞总数的扩增倍数在第7天时仅0.2～0.5倍，这是由于电转造成了部分细胞死亡；如图6b所示，与k562-t1细胞共培养后，在第7～14天、第14～21天以及第21～28天，每七天的细胞总数扩增倍数在20～50倍之间，28天细胞总数的扩增倍数共计在4000～20000倍范围内。
[0130]
如图7所示，在第28天，car-t细胞中的effector memory细胞(cd45ra-ccr7-)表型占到60％以上，effector细胞(cd45ra ccr7-)表型占30％左右，(cd45ra ccr7 )和central memory(cd45ra-ccr7 )的表型占10％以下，说明采用本发明的方法扩增的car-t细胞中含有较多的effector memory表型，使得car-t细胞在体内会有较好的持续性。
[0131]
实施例6 nkg2d-car-t细胞对肿瘤细胞的体外杀伤情况
[0132]
根据实施例3的方法，进行nkg2d-car-t细胞的制备，并分别在第7、14、21、28天计数，取样进行流式检测分析，并检测不同培养天数的car-t/gfp-t细胞对人结直肠癌细胞株hct116的体外杀伤情况。gfp-t细胞为实施例4制备的gfp-t细胞，具体为将质粒3替换为质粒4，制备gfp-t细胞，并在与k562-t1共培养的过程中，分别在培养第7、14、21天添加100ng/ml okt3。
[0133]
流式检测分析采用的抗体组合为fitc-结合的抗strep tag ii抗体单染(培养第14、21天)或fitc-结合的抗strep tag ii抗体 apc-结合的抗人nkg2d抗体共染(培养第7天)。
[0134]
如图8a所示，培养第7天时car-t中car /nkg2d 的细胞比例为33％，如图8b所示，培养第14天时car-t中car 的细胞比例为55.9％，如图8c所示，培养第21天时car-t中car 的细胞比例为98.3％。
[0135]
将培养第7、14、21天的gfp-t细胞或nkg2d-car-t细胞(效应细胞)分别与5
×
103个人结直肠癌细胞株hct116(靶细胞)共培养于u型96孔板(nunc公司)，上述效应细胞与靶标细胞的个数比例(e:t)为(1.25～40):1或(2.5～40):1，每组实验重复3次；经过4小时的共培养后，采用delfia eutda细胞毒性试剂盒(美国perkinelmer公司)检测gfp-t细胞和nkg2d-car-t细胞溶解肿瘤细胞的能力，杀伤效果的公式计算为：
[0136]
％特异性裂解＝((实验组释放(读数)-自然释放(读数))/(最大释放(读数)-自然释放(读数)))
×
100
[0137]
如图8d、图8e和图8f所示，在培养第7天时，nkg2d-car-t细胞对hct116的杀伤(e:t 10:1)约为50％，在培养第14天时约为60％，在培养第21天时约为90％。随着nkg2d-car阳性细胞所占比例的增加，car-t细胞对hct116细胞的体外杀伤呈现逐步增强的效果，而gfp-t(图中显示为“gfp-t”)对hct116的杀伤一直维持在较低水平。
[0138]
实施例7 nkg2d-car-t细胞对人胃癌细胞株mgc-803生长的影响
[0139]
根据实施例3的方法，进行nkg2d-car-t细胞的制备。rtca实验开始第0小时，将mgc-803铺于16孔电极板(acea bio)中，密度为5000个细胞/孔；约24小时后，将培养第28天的nkg2d-car-t细胞(效应细胞)分别按e:t＝1:1或5:1的比例接种于电极板中，总体积为200μl，每组实验重复2次；用xcelligence rtca检测nkg2d-car-t细胞对mgc-803生长的影响。
[0140]
如图9所示，未加入car-t细胞组(黑线)，肿瘤细胞持续生长至60个小时；加入car-t细胞后，肿瘤细胞被迅速杀伤，其中e:t＝5:1时的杀伤速度比e:t＝1:1时快，直到实验结束肿瘤细胞也没有再次生长起来。这表明nkg2d-car-t细胞可以有效抑制胃癌细胞mgc-803的生长。
[0141]
实施例8利用piggybac转座子系统制备car-t(两步法)
[0142]
制备流程图如图10所示：
[0143]
第0天，将5
×
106个pbmc用10ml opti-mem重悬，300
×
g离心10min；将细胞沉淀重悬于100μl p3 buffer中，加入5μg质粒5和10μg质粒3，混匀后转移至电lonza电击杯；将电击杯置于lonza4d-nucleofectortm x unit(单电击杯模块中)，进行电转，电转结束后，将一个cuvette中的t细胞悬液缓慢转移至一个t75培养瓶中，加入1
×
107个k562-t1(实施例2制备，100gyγ射线辐照)，将培养基体积补齐至20ml，加入hril-2使其终浓度为300iu/ml；
[0144]
第0天至第7～10天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有300iu/ml hril-2的t细胞培养液；
[0145]
第7～10天，收获全部细胞进行计数，取2
×
106个细胞进行流式细胞表型分析(抗人cd3抗体、抗strep-tag ii抗体、抗人cd45ra和抗人ccr7抗体、抗人nkg2d抗体)；将2
×
106个细胞与4
×
106个k562-t1(实施例2制备，100gyγ射线辐照)重悬于10ml培养基，加入hril-2使其终浓度300iu/ml；
[0146]
在接下来共培养的7天中，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有300iu/ml hril-2的t细胞培养液；
[0147]
第二轮共培养7天后，收获全部细胞进行计数，取2
×
106个细胞进行流式细胞表型分析(抗人cd3抗体、抗strep-tag ii抗体、抗人cd45ra和抗人ccr7抗体、抗人nkg2d抗体)。
[0148]
实施例9两步法制备的nkg2d-car-t的扩增倍数和细胞表型
[0149]
根据实施例8的方法，采用来自3个捐献者(donor 1、donor 2、donor3)的pbmc进行nkg2d-car-t细胞的制备，并分别在培养第7～10、14～17天计数，取样进行流式检测分析，所用抗体组合为(1)pe-结合的抗人cd3抗体，(2)fitc-结合的抗strep tag ii抗体，(3)fitc-结合的抗人cd45ra抗体 apc-结合的抗人ccr7抗体。
[0150]
如图11a所示，在car-t培养第7～10和14～17天(具体为donor 1在培养第8天和第15天，donor 2在培养第7天和第14天，donor 3在培养第10天和第17天)，细胞群体中cd3 的细胞比例均在80％以上；如图11b所示，在car-t培养第7～10天，细胞群体中car 的细胞比
例在80％以上，在培养第14～17天，群体中car 的细胞比例仍然维持在80％以上。
[0151]
如图12a所示，以起始pbmc数量计算，细胞总数的扩增倍数在第7～10天时仅2～7倍，这是由于电转造成了部分细胞死亡；图12b所示，与k562-t1细胞共培养后，在培养第14～17天，细胞总数扩增倍数在20～70倍之间，14～17天细胞总数的扩增倍数共计在150-500倍范围内。
[0152]
如图13所示，在培养第14～17天，car-t细胞中的effector memory(cd45ra-ccr7-)表型占到50％左右，effector细胞(cd45ra ccr7-)的表型占40％左右，(cd45ra ccr7 )和central memory (cd45ra-ccr7 )的表型占10％以下，说明采用本发明的方法扩增的car-t细胞中同样含有较多的effector memory表型，使得car-t细胞在体内会有较好的持续性。
[0153]
实施例10 nkg2d-car-t细胞对卵巢癌细胞株skov3生长的影响
[0154]
根据实施例8的方法，进行nkg2d-car-t细胞的制备。rtca实验开始第0小时，将skov3铺于16孔电极板(acea bio)中，密度为5000个细胞/孔；约4小时后，将培养第15天的nkg2d-car-t细胞(效应细胞)分别按e:t＝10:1或2.5:1的比例接种于电极板中，总体积为200μl，每组实验重复2次；用xcelligence rtca检测nkg2d-car-t细胞对skov3生长的影响。
[0155]
如图14所示，未加入car-t细胞组(黑线)，肿瘤细胞持续生长；加入car-t细胞后，肿瘤细胞被迅速杀伤，其中e:t＝10:1时的杀伤速度比e:t＝2.5:1时快，直到实验结束肿瘤细胞也没有再次生长起来。这表明nkg2d-car-t细胞可以有效抑制卵巢癌细胞skov3的生长。
[0156]
实施例11在小鼠皮下结直肠癌模型中检测nkg2d-car-t对肿瘤生长的影响
[0157]
本实施例进一步利用小鼠结直肠癌模型检测nkg2d-car-t细胞的体内抑瘤效果。
[0158]
实验用小鼠为nod/scid/γc-/-(nsg)小鼠(6-8周，雌性)，每只小鼠在皮下植入2
×
106个人结直肠癌细胞系hct116-luc，建立结直肠癌皮下模型；肿瘤移植4天后，向小鼠按12mg/kg的剂量腹腔注射环磷酰胺清髓；肿瘤移植5天后，利用活体生物成像技术(bli)，在ivis spectrum成像平台观测肿瘤的生长情况，并用成像仪(美国perkinelmer公司)拍照记录肿瘤的生长情况；具有相似bli强度(bli强度指活体成像仪记录的小鼠体内肿瘤细胞荧光强度)的小鼠被随机分为3组，分别为：磷酸盐缓冲液(pbs)组、ctrlαβ-t细胞组、nkg2d-car-t细胞组，每组5只小鼠；ctrlαβt细胞组或nkg2d-car-t细胞组通过尾静脉注射向每只小鼠每次注射1
×
107个细胞，pbs组通过尾静脉注射向每只小鼠每次注射100μl pbs；之后密切观察小鼠的行为和生存情况，并通过bli记录肿瘤的发展状况，所有光信号和图片采用xenogen活体成像软件v2.5记录分析。ctrlαβt细胞的制备为在实施例3的方法中，去除电转的步骤，在与k562-t1共培养时添加100ng/ml okt3。
[0159]
如图15所示，肿瘤移植25天后，pbs组和ctrlαβt细胞组(图中显示为“controlαβt cells”)的小鼠肿瘤持续生长，每组各有两只小鼠已经死亡，而nkg2d-car-t细胞组(图中显示为“nkg2d carαβt cells”)的小鼠肿瘤部分缓解，肿瘤大小显著小于pbs组和ctrlαβt细胞组。
[0160]
如图16所示，肿瘤移植32天后，pbs组和ctrlαβt细胞组的所有小鼠全部死亡，而nkg2d-car-t组的所有小鼠一直存活至第45天。由此可见，通过piggy bac转座子制备的nkg2d-car-t细胞能够有效抑制小鼠皮下的结直肠癌肿瘤生长。
[0161]
实施例12在小鼠结直肠癌肺转移模型中检测nkg2d-car-t对肿瘤生长的影响
[0162]
本实施例利用小鼠结直肠癌肺转移模型检测nkg2d-car-t细胞的体内抑瘤效果。
[0163]
实验用小鼠为nod/scid/γc-/-(nsg)小鼠(6-8周，雌性)，每只小鼠通过尾静脉植入5
×
105个人结直肠癌细胞系hct116-luc，建立结直肠癌肺转移模型；肿瘤移植3天后，利用活体生物成像技术(bli)，在ivis spectrum成像平台观测肿瘤的生长情况，并用成像仪(美国perkinelmer公司)拍照记录肿瘤的生长情况；具有相似bli强度(bli强度指活体成像仪记录的小鼠体内肿瘤细胞荧光强度)的小鼠被随机分为2组，分别为：磷酸盐缓冲液(pbs)组和nkg2d-car-t细胞组，每组2只小鼠；nkg2d-car-t细胞组通过尾静脉注射向每只小鼠每次注射1
×
107个细胞，pbs组通过尾静脉注射向每只小鼠每次注射100μl pbs；之后密切观察小鼠的行为和生存情况，并通过bli记录肿瘤的发展状况，所有光信号和图片采用xenogen活体成像软件v2.5记录分析。
[0164]
如图17所示，肿瘤植入后第10、24天，pbs组的小鼠肿瘤持续生长，而nkg2d-car-t细胞组(图中显示为“nkg2d car-t cells”)的小鼠肿瘤部分缓解，肿瘤大小显著小于pbs组。由此可见，通过piggy bac转座子制备的nkg2d-car-t细胞能够有效抑制小鼠肺转移中肿瘤的生长。
[0165]
实施例13在小鼠卵巢癌肺转移模型中检测nkg2d-car-t对肿瘤生长的影响
[0166]
本实施例利用小鼠卵巢癌肺转移模型检测nkg2d-car-t细胞的体内抑瘤效果。
[0167]
实验用小鼠为nod/scid/γc-/-(nsg)小鼠(6-8周，雌性)，每只小鼠通过尾静脉植入5
×
105个人卵巢癌细胞系skov3-luc，建立卵巢癌肺转移模型；肿瘤移植3天后，利用活体生物成像技术(bli)，在ivis spectrum成像平台观测肿瘤的生长情况，并用成像仪(美国perkinelmer公司)拍照记录肿瘤的生长情况；具有相似bli强度(bli强度指活体成像仪记录的小鼠体内肿瘤细胞荧光强度)的小鼠被随机分为2组，分别为：磷酸盐缓冲液(pbs)组和nkg2d-car-t细胞组，每组2只小鼠；nkg2d-car-t细胞组通过尾静脉注射向每只小鼠每次注射1
×
107个细胞，pbs组通过尾静脉注射向每只小鼠每次注射100μl pbs；之后密切观察小鼠的行为和生存情况，并通过bli记录肿瘤的发展状况，所有光信号和图片采用xenogen活体成像软件v2.5记录分析。
[0168]
如图18所示，肿瘤植入后第45天，pbs组的小鼠肿瘤持续生长，而nkg2d-car-t细胞组(图中显示为“nkg2d car-t cells”)的小鼠肿瘤几乎完全被清除。由此可见，通过piggy bac转座子制备的nkg2d-car-t细胞能够有效杀死小鼠肺转移的肿瘤细胞。
[0169]
综上所述，本发明采用非病毒的方法，利用pb转座子系统和人工抗原呈递细胞k562制备、扩增和富集car-t细胞，生产周期短、生产成本低，制备的car-t细胞纯度高、安全性好，对肿瘤细胞具有显著的杀伤和/或抑制作用。
[0170]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。