枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分泌的Ericin1a抗菌肽及其应用的制作方法

枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分泌的ericin1a抗菌肽及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分泌的 ericin1a抗菌肽及其应用。


背景技术：

2.抗生素的滥用是养殖业的一个非常严重的问题。不仅造成了抗生素在肉蛋奶中的残留，影响人们的身体健康，而且在过去的十年中，能耐受多种抗生素的超级细菌的迅速出现已成为全球关注的问题，这促使人们寻找用于畜禽养殖的的替代抗菌剂。由细菌，昆虫，两栖动物和哺乳动物以及化学合成产生的抗菌肽(amp)，由于其天然的抗菌特性，无残留以及对微生物产生抗药性的倾向较低，因此是替代抗生素的新型抗菌剂的有力候选者。根据国外最新的研究进展，y.kaznessis,d'silva,l.dicks等英美的科学家成功地将表达抗菌型活性小肽的益生菌应用于实验动物和养殖，取得了良好的抗菌疗效，并通过长期观察，未见不良反应。一项韩国研究表明，在每日饲料中添加60mg/kg抗菌肽p5(amp-p5)来替代抗生素，可以改善肉鸡的生长性能，营养吸收，肠道健康状况，并减少肉鸡的肠道和粪便中的大肠菌群。
3.抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有抑菌活性的小分子多肽。些物种的昆虫、哺乳动物和微生物等都有产生抗菌活性小肽的能力，例如两栖动物蛙的皮肤中分离到的蛙皮素(magainins)和昆虫天蚕幼虫分泌的天蚕素(cecropin ad)等。抗菌活性小肽是纯天然的肽，具有广谱抗菌活性，可以快速查杀靶标，使它迅速成为潜在的治疗药物。抗菌活性小肽的作用机制至今还没有完全弄清楚。目前研究显示，抗菌活性小肽是通过作用于细菌细胞膜而起作用的。天蚕素类抗菌活性小肽作用于细胞膜，插入磷脂膜形成跨膜的通道，破坏了膜的完整性，造成细胞内物质的泄漏，从而杀死细胞。但对其具体作用过程、是否存在特异性的膜受体、有无其它因子协同等问题尚不十分清楚，存在不同看法。不同抗菌活性小肽的作用机制可能不一样，尚有待进一步研究。抗菌活性小肽具有广谱抗菌活性，作用范围包括：革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、寄生虫、肿瘤细胞等。抗菌活性小肽对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视。
4.我国畜禽养殖业中生猪、蛋鸡和肉鸡占有重要比重，各种细菌性传染病严重威胁着养殖业，导致饲料报酬率降低，成活率下降，增重缓慢，生长发育停滞甚至死亡，严重威胁着养殖业的健康发展。例如，仔猪腹泻是集约化养猪生产条件下的一种典型的多因素性疾病，主要由革兰氏阴性细菌和革兰氏阴性菌猪痢疾密螺旋体导致，传播流行期长，发病率高死亡率低且易复发；鸡沙门氏菌病是由沙门氏菌属成员引起的一组传染病，主要包括鸡白痢、鸡伤寒和鸡副伤寒，发病率和致死率高，病鸡即使康复，生产性能也会下降，常终身带菌成为传染源，对种鸡场危害很大；沙门氏菌病是人兽共患病，带菌的产品常引起人的食物中毒，是公共卫生上的重大危害。
5.为了预防和治疗猪细菌性腹泻等和鸡沙门氏菌病等细菌性传染病，养殖场大量使
用而各种抗生素和化学药物，造成了肉类抗生素和化药残留超标，不仅威胁人们的身体健康，也使肉类的品质和价格难以提高。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
7.本发明还有一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌，为经过诱变筛选获得的抗菌活性进一步得到增强的菌株，使之能在动物肠道内持续分泌表达ericin1a抗菌肽，兼有益生菌和抗菌活性小肽的优点，并且无毒副作用，无抗生素残留，代替传统抗生素的使用，提升生命科学技术水平。
8.本发明还有一个目的是提供一种ericin1a抗菌肽，其可以代替抗生素用于制备预防细菌性疾病的抑菌剂，对减少抗生素的滥用起到重要作用。
9.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)gf158，该菌株已于2021年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为：cgmccno.23153。
10.一种ericin1a抗菌肽，所述ericin1a抗菌肽由枯草芽孢杆菌分泌获得。
11.优选的是，所述ericin1a抗菌肽的氨基酸序列如seq id no:1所示。
12.优选的是，所述ericin1a抗菌肽的核苷酸序列如seq id no:2所示。
13.一种ericin1a抗菌肽在制备针对革兰氏阴性细菌的抑菌剂中的应用。
14.优选的是，革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或痢疾志贺菌。
15.一种枯草芽孢杆菌在制备预防或防治革兰氏阴性细菌传染病的禽畜饲料中的应用。
16.一种禽畜饲料，所述禽畜饲料内添加有如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。
17.优选的是，所述禽畜饲料中枯草芽孢杆菌的添加量为150-600g/t。
18.本发明至少包括以下有益效果：
19.本发明基于生物防治的理念，广泛从各地的土壤中筛选能有效抑制致病菌的益生菌，通过诱变的方法，筛选获得抗菌活性进一步得到增强的菌株，使之能在动物肠道内持续分泌表达ericin1a抗菌肽，兼有益生菌和抗菌活性小肽的优点，并且无毒副作用，无抗生素残留，代替传统抗生素的使用，提升生命科学技术水平。
20.本发明提供的枯草芽孢杆菌兼具有益生菌功能及分泌提供具有抗病功能的ericin1a 抗菌肽，目前国内市场鲜见。本发明提供的ericin1a抗菌肽是自然界存在的天然高效抗菌生物活性小肽，具有广谱抗菌、无毒副作用、不产生抗体、无耐药性、无残留、无污染的优点，是真正的绿色抗菌剂，将大大推动解决药物残留的食品安全问题，加强绿色畜牧养殖业的发展，保护京津冀人民的食品安全。
21.本发明通过将枯草芽孢杆菌适量添加入禽畜饲料中，动物摄入后，菌体可以经受强酸性胃酸的破坏，使益生菌到达消化道，到达肠道里大量繁殖，并持续分泌ericin1a抗菌肽到动物肠道中，能够有效替代抗生素的使用，对细菌导致的畜禽传染病起到有效的预防作用。表达基因位于益生菌的基因组中，不需要加入抗生素来保持质粒的存在,也不需要加诱导剂诱导表达。枯草芽孢杆菌菌株不含任何抗生素抗性选择标记，生物安全性大大提高。
22.本发明提供的枯草芽孢杆菌可以直接添加到饲料中，不仅对禽畜机体产生持续的保护作用，还能够大幅度减少传统的抗生素的使用，并且无毒无害，是一种绿色的生物保护剂。
23.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
24.图1为本发明ericin1a抗菌肽的三维空间结构；
25.图2为本发明产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158(保藏编号cgmcc no. 23153)对大肠杆菌(左图)、沙门氏菌(中图)和痢疾志贺菌(右图)的抑菌实验；
26.图3为本发明枯草芽孢杆菌gf158的小鼠生物安全实验器官重量比例；
27.图4为本发明添加产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158的禽畜饲料喂养肉鸡的存活率实验，其中，每吨鸡饲料中添加300克枯草芽孢杆菌gf158；
28.图5为本发明添加产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158的禽畜饲料喂养肉鸡的存活率实验，其中，每吨鸡饲料中添加150克枯草芽孢杆菌gf158；
29.图6为本发明添加产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158的禽畜饲料喂养肉鸡的存活率实验，其中，每吨鸡饲料中添加600克枯草芽孢杆菌gf158；
30.图7为本发明添加产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158的禽畜饲料喂养肉鸡的存活率实验，其中，每吨猪饲料中添加300克枯草芽孢杆菌gf158。
具体实施方式
31.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
32.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
33.实施例1
34.1.1高效抗菌肽益生菌菌株分离筛选及鉴定
35.菌株分离筛选，从北京平谷某地的土壤中进行了取样，并进行了枯草芽孢杆菌的分离。首先称取土壤1-10g，倒入灭菌锥形瓶，加入50-200ml的灭菌双蒸水，用70％酒精棉擦拭过的玻璃棒搅匀后，在涡旋混匀仪上振荡1-10分钟，使土壤中的微生物充分释放到溶液中。由于枯草芽孢杆菌可以产生抗逆性强的芽孢，能够耐受高温，因此采用高温处理的方法，杀死其它不耐热的土壤微生物，从而有选择性地筛选枯草芽孢杆菌。
36.将锥形瓶放入75-95℃水浴锅中煮12-20分钟，这个过程会杀死绝大多数不耐高温的微生物。结束后将锥形瓶放在室温自然冷却。然后用灭菌双蒸水进行1x102、1x104和 1x106的梯度稀释，分别取200-300ul稀释液，涂布到lb平板或其他适合枯草芽孢杆菌生长的平板上，28-37℃培养24-48小时，对长出的菌落进行分析。
37.将筛选获得菌种用biolog菌种鉴定系统进行96孔板分析，确定筛选到的菌种为一株枯草芽孢杆菌.
38.1.2菌株的诱变增强
39.由于筛选到的枯草芽孢杆菌益生菌虽然对致病菌有一定的抑制作用，但其抑菌性不够高，因此采用诱发突变的方法对其抑菌性进行增强。具体方法为：在lb平板或者其它适合枯草芽孢杆菌生长的营养琼脂平板上划单菌落，37℃过夜培养。挑取形态健康的单菌落，接种10毫升lb液体培养基，过夜培养。
40.将菌悬液在1500-6000rpm离心3-10分钟以沉淀细胞，小心吸掉上清液。
41.1500-6000rpm离心3-10分钟以沉淀细胞，用灭菌pbs缓冲溶液或其它菌体无害的无菌溶液或灭菌水将菌体沉淀小心重悬洗涤，并重复此洗涤离心步骤1-2次。
42.再次用灭菌水重悬菌体，进行合适倍数的稀释后，用可见光分光光度计检测600nm的光吸收数值。吸光度和菌体数量的对应关系是：当od600＝1时，每毫升的菌数约为8x108个。
43.根据测定的菌体浓度，取1x108个细胞，离心收集菌体，弃去上清液。
44.ems工作溶液制备：在通风橱中，在盛有2mllb培养基的离心管中加入50ul液体ems(偏二磺酸乙酯，也称为甲烷磺酸乙酯，sigma#m-0880)，制成0.1mems的溶液。轻轻搅拌直至粘稠的油状液体完全溶解。用同样方法，制备25μl/ml,50μl/ml,75μl/ml和100μl/ml浓度的ems工作溶液。
45.ems诱变：用ems工作溶液轻柔重悬菌体，在室温分别静置处理30,60,90,120分钟。处理完成后，1500-6000rpm离心3-10分钟以沉淀细胞，弃上清，用lb培养基重悬离心，洗涤细胞2-3次。
46.用菌pbs磷酸盐缓冲液、灭菌去离子水或其它对菌体无害的无菌溶液将ems处理过的菌液稀释1x10
2-1x107倍，并将不同稀释度的菌液涂lb平板，37℃培养24-48小时。
47.ems溶液的灭活：将ems溶液与等体积的“灭活溶液”[0.1mnaoh，20％w/vna2s2o3(硫代硫酸钠)]混合24小时来灭活。在处理之前，应将所有受ems污染的吸管/试管浸泡在灭活溶液中24小时。
[0048]
诱变后的ericin1a抗菌肽和原始抗菌肽的序列比较：
[0049]
经测序，发现诱变筛选的ericin抗菌肽基因序列有4处发生了突变。
[0050]
分别是：e4a,v15k,l16k和q22f
[0051]
upperline:ericins,from1to32
[0052]
lowerline:modifiedericinthathasenhancedantibioticactivity,from1to32
[0053]
ericin:modifiedericin1athathasenhancedantibioticactivityidentity＝87.5％(28/32)gap＝0.00％(0/32)
[0054][0055]
和原始序列比较，ericin1a抗菌肽的32个氨基酸中有4个产生了突变，其3d结构如图1所示。
[0056]
实施例2
[0057]
抑菌活性检测
[0058]
将生长的单菌落分别挑出，扩大培养后检测对鸡肠道和粪便分离出的革兰氏阴性
致病菌的抑菌活性。
[0059]
具有抑菌效果的诱变菌株检测采用经典的抑菌圈法，具体方法为：
[0060]
(1).将枯草芽孢杆菌实验菌和对照菌接种到5ml lb液体培养基中，37℃，200r/min培养 12h-16h。
[0061]
(2).将从病鸡的粪便中分离的沙门氏菌在lb固体培养基上接种划线，37℃培养过夜。
[0062]
(3).用接种针挑取沙门氏菌的单菌落接种到lb液体培养基中，37℃、200r/min培养12
‑ꢀ
24h。
[0063]
(4).将培养好的沙门氏菌的原液用无菌水稀释10倍，在560nm处用分光光度计测菌浓度。
[0064]
(5).根据测得的浓度，将原液稀释相应的倍数，吸取100-250μl涂布在lb平板上。
[0065]
(6).将市售枯草芽孢杆菌对照、金福赛一代草芽孢杆菌对照、枯草芽孢杆菌gf118的发酵液12000r/min离心1min，取上清吸入一次性注射器中用已灭菌的针头滤器(0.45μm)过滤除菌，并配置卡那霉素(1000μg/ml)(正对照)溶液，并过滤灭菌。
[0066]
(7).在涂布了e.coli致病菌的lb固体培养基上均匀放置四个牛津杯，并做好标记，然后将市售枯草芽孢杆菌对照、金福赛一代草芽孢杆菌对照、枯草芽孢杆菌gf118的发酵液加满牛津杯，剩余一个牛津杯中加入20μl卡那霉素(正对照)。
[0067]
(8).将完成的平皿放入30-37℃恒温培养箱培养12-36小时，观察抑菌圈的大小。
[0068]
结果如图2所示，产ericin1a抗菌肽的gf158益生菌发酵上清液对大肠杆菌、沙门氏菌和痢疾志贺菌等革兰氏阴性致病菌具有显著的抑制作用。
[0069]
实施例3
[0070]
生物安全实验
[0071]
进行小鼠安全实验，将表达的ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158以不同菌量添加到鼠粮中，选取spf级4周龄的balb/c小鼠，将其随机分成4组，每组10只，连续喂养小鼠2周，称重。试验结束后将对照组和实验组小鼠解剖，分别对肝脏、肾脏、脾脏和肺进行称重。
[0072]
实验结果显示，饲料中添加不同剂量的试验小鼠各器官重量比与对照组相比并无太大差异(图3)，显现枯草芽孢杆菌gf158对于试验小鼠不会造成器官肿大的副作用。总体增重方面，1倍剂量、10倍剂量和50倍剂量添加的实验组与对照组0-7天和0-14天的总体增重速度和对照组无明显降低，甚至略有提高(表1)，因此可知枯草芽孢杆菌 gf158具备安全性。
[0073]
表1各组平均日增重比较
[0074]
试验组别头实验0～7天期实验0～14天期对照组51.09
±
0.301.53
±
0.271x剂量添加101.17
±
0.151.59
±
0.1210x剂量添加101.23
±
0.241.80
±
0.3050x剂量添加101.16
±
0.091.62
±
0.10
[0075]
实施例4
[0076]
肉鸡存活率实验
[0077]
在同一个养鸡场，选取同一个鸡舍、同一个品种和日龄的白羽肉鸡2000只，随机分
为2组，每组1000只。实验组在每吨鸡饲料中添加300克产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158，对照组不添加。采取双盲实验的原则，连续饲喂3周，在实验结束时计算存活率。采用计算公式为：
[0078]
总体存活率＝3周后剩余肉鸡数量
÷
实验初始肉鸡数量x 100％
[0079]
实验结果如图4所示，每吨鸡饲料中添加300克产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌 gf158的实验组，3周后存活率为99.1％，而未添加枯草芽孢杆菌gf158的对照组，存活率仅为94.2％。由此可见，在饲料中添加产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158能够显著提高肉鸡的存活率。
[0080]
实施例5
[0081]
肉鸡存活率实验
[0082]
在同一个养鸡场，选取同一个鸡舍、同一个品种和日龄的白羽肉鸡2000只，随机分为2组，每组1000只。实验组在每吨鸡饲料中添加150克产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158，对照组不添加。采取双盲实验的原则，连续饲喂3周，在实验结束时计算存活率。采用计算公式为：
[0083]
总体存活率＝3周后剩余肉鸡数量
÷
实验初始肉鸡数量x 100％
[0084]
实验结果如图5所示，每吨鸡饲料中添加150克产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌 gf158的实验组，3周后存活率为98.6％，而未添加枯草芽孢杆菌gf158的对照组，存活率仅为94.3％。由此可见，在饲料中添加产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158能够显著提高肉鸡的存活率。
[0085]
实施例6
[0086]
肉鸡存活率实验
[0087]
在同一个养鸡场，选取同一个鸡舍、同一个品种和日龄的白羽肉鸡2000只，随机分为2组，每组1000只。实验组在每吨鸡饲料中添加600克产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158，对照组不添加。采取双盲实验的原则，连续饲喂3周，在实验结束时计算存活率。采用计算公式为：
[0088]
总体存活率＝3周后剩余肉鸡数量
÷
实验初始肉鸡数量x 100％
[0089]
实验结果如图6所示，每吨鸡饲料中添加600克产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158的实验组，3周后存活率为99.8％，而未添加枯草芽孢杆菌gf158的对照组，存活率仅为94.1％。由此可见，在饲料中添加产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158能够显著提高肉鸡的存活率。
[0090]
实施例7
[0091]
牲畜存活率实验
[0092]
选取42天左右，体重在12kg左右的仔猪300头，随机分为6组，3个实验组和3 个对照组，每组50只。实验组在每吨猪饲料中添加300克产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌gf158益生菌，对照组不添加。采取双盲实验的原则，连续饲喂90天直至出栏，在实验结束时计算存活率。采用计算公式为：
[0093]
总体存活率＝90天后存活猪数量
÷
实验初始猪数量x 100％
[0094]
实验结果如图7所示，每吨饲料中添加300克产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌 gf158益生菌的实验组，90后存活率为96.6％，而未添加枯草芽孢杆菌gf158的对照组，存活
率仅为85.1％。由此可见，在饲料中添加产ericin1a抗菌肽的枯草芽孢杆菌 gf158益生菌能够显著提高猪只的存活率。
[0095]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。