一种Nf1基因敲除动物模型的构建方法

一种nf1基因敲除动物模型的构建方法
技术领域
1.本技术涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种nf1基因敲除动物模型的构建方法。


背景技术：

2.i型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1,nf1)是由于nf1基因突变所导致的常染色体显性遗传病，是整复外科最常见的皮肤软组织肿瘤性疾病之一，发病率约为1：3500。nf1突变或缺失导致神经纤维蛋白失活，活化的ras不能水解转化为非活化的ras，ras通路持续异常激活导致细胞异常增生的病变。患者以schwann细胞异常增殖的良性神经纤维瘤包括皮肤型神经纤维瘤和丛状神经纤维瘤纤维瘤为主要表现。
3.因nf1突变始于受精卵期，病变可累及皮肤、骨骼、血管、神经等多个系统，临床表现多样，但神经纤维瘤是nf1患者的特征性表型和主要就医诉求。神经纤维瘤虽为良性肿瘤，仍可造成周围组织破坏，引起患者容貌畸形、剧烈疼痛和功能障碍，对患者身心是严重的摧残，对家庭和社会是沉重的负担。神经纤维瘤发病机制尚未完全阐明，无针对性的靶向治疗方案，与其他肿瘤的治疗形成强烈反差，是限制神经纤维瘤治疗的重要瓶颈。
4.深入研究i型神经纤维瘤发生发展机制以及有效的靶向治疗措施，迫切需要一种真实地反映i型神经纤维瘤进展过程且重复性好的动物模型。转基因小鼠是针对这类肿瘤最合适的动物模型之一，然而文献报道nf1-/-纯合敲除小鼠胚胎致死，而杂合子有淋巴系统肿瘤、白血病等多种肿瘤发展倾向并且存在空间学习能力受损，但不能生成神经纤维瘤。进一步研究发现，如果在杂合nf1的小鼠基础上，在施万细胞中特异性的纯合敲除nf1(nf1flox/-；krox20-cre mice)后表现出丛状神经纤维瘤。然而目前使用的传统cre小鼠技术相对操作困难，同时扩展性相对较低，近年来crispr技术得以发展，与传统基因组编辑工具相比，它更易于操作，性价比高，具有更强的可扩展性，但是目前尚未有相关技术在nf1疾病丛状神经纤维瘤小鼠模型成瘤相关报道。同时，国内目前尚未有包括传统cre基因编辑小鼠、crispr基因编辑小鼠在内的相关模型建模成功的报道。
5.综上所述，国内尚无nf1相关模型建立，其技术难度大，这是影响我国nf1相关研究水平提高的重要制约因素之一。建立一种重复性高、可控性好的i型神经纤维瘤模型是推动该领域研究进展以及最终惠及临床治疗的重要保障。


技术实现要素：

6.本技术提供一种nf1基因敲除动物模型的构建方法，该模型重复性高、可控性好，弥补了目前相关模型缺乏的不足。
7.本技术提供一种nf1基因敲除动物模型的构建方法，包括：设计识别nf1基因的grna；进行体外转录，获得cas9 mrna和grna；构建同源重组载体；将cas9 mrna、grna和同源重组载体显微注射到动物的受精卵中，获得f0代动物；将阳性f0代动物与野生型动物交配，获得f1代动物。
8.可选的，在本技术的一些实施例中，所采用的动物为小鼠，nf1基因敲除小鼠模型
品系全名为c57bl/6j-nf1
em1(flox)smoc
。
9.本技术采用crispr/cas9技术制备i型神经纤维瘤nf1基因施万细胞条件性敲除成瘤小鼠动物模型。crispr/cas9系统是通过向导rna(grna)与目标dna匹配，从而指导cas9蛋白与特定基因位点结合并进行剪切。本技术通过设计针对nf1基因的grna引导cas9核酸酶对插入位置的基因组进行修饰，从而造成该基因修饰区域同源重组效率增加，将目的片段同源重组到目的位点。具体地，将cas9 mrna、grna和同源重组载体混匀后，注射入小鼠的受精卵中，则cas9蛋白在grna的靶向作用下对nf1基因的dna双链进行切割，从而诱发同源重组修复机制以同源重组载体为模板对损伤的nf1基因进行修复，将loxp序列整合到小鼠基因组中的特定位点。
10.在本技术中，条件性基因敲除是通过染色体位点特异性重组酶系统cre-loxp来实现的，将两个loxp位点放到目的基因一个或几个重要的外显子两端，制备出flox小鼠，该目的基因表达不受loxp插入的影响，而当flox小鼠与该组织特异性表达cre酶的小鼠进行杂交后，cre酶的组织特异性表达可以促进目的基因两侧的loxp位点发生重组，目的基因完整性被破坏，从而发生基因沉默，而该基因在其他组织或细胞表达正常。
11.可选的，在本技术的一些实施例中，grna的序列seq id no.1至seq id no.3所示。
12.可选的，在本技术的一些实施例中，同源重组载体包含3.0kb 5’同源臂、2.9kb的flox区域和3.0kb 3’同源臂。
13.可选的，在本技术的一些实施例中，同源重组载体的构建方法包括：用infusion方法将5’同源臂、flox区域和3’同源臂的目的片段连接到pbr-322载体上；采用infusion方法，目的dna片段无需经过限制性内切酶酶切处理，在in-fusion酶作用下便可直接定向克隆到载体中，是一种简便、快速、高效的克隆技术，不附加任何多余序列，不受限制性内切酶酶切位点的限制，可同时克隆两个或多个dna片段。
14.可选的，在本技术的一些实施例中，用如seq id no.8和seq id no.9所示的序列作为引物，以野生型小鼠基因组作为模板，pcr扩增获得5’同源臂的目的片段；和/或，用如seq id no.10和seq id no.11所示的序列作为引物，以野生型小鼠基因组作为模板，pcr扩增获得flox区域的目的片段；和/或，用如seq id no.12和seq id no.13所示的序列作为引物，以野生型小鼠基因组作为模板，pcr扩增获得3’同源臂的目的片段。
15.可选的，在本技术的一些实施例中，在f0代小鼠与野生型小鼠交配前，对f0代小鼠进行基因检测及鉴定，得到阳性f0代小鼠。
16.可选的，在本技术的一些实施例中，基因检测及鉴定所需pcr引物序列如seq id no.4至seq id no.7所示。
17.可选的，在本技术的一些实施例中，小鼠为c57bl/6j小鼠。
18.可选的，在本技术的一些实施例中，构建方法还包括：将f1代小鼠与具有施万细胞特异性cre表达的小鼠交配，获得施万细胞条件性敲除nf1基因小鼠模型。
19.本技术采用crispr/cas9技术制备i型神经纤维瘤nf1基因敲除成瘤小鼠动物模型，具有以下有益效果：
20.1)本技术采用crispr/cas9技术制备nf1基因敲除小鼠模型，crispr/cas9技术与传统基因组编辑工具相比，它更易于操作，性价比高，具有更强的可扩展性。
21.2)本技术为国内首个能够自发形成丛状神经纤维瘤的nf1转基因小鼠模型，该动
物模型重复性高、可控性好，易于饲养繁殖，弥补了现在国内在该领域缺乏稳定可控的体内研究平台这一缺陷动物模型的不足，且更稳定、更符合临床特点，为i型神经纤维瘤发生机制研究及干预措施的探索提供了更好的平台。利用这个平台，对于i型神经纤维瘤发病机制以及药物治疗的研究将进一步深入且更加科学。
附图说明
22.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1是采用crispr/cas9技术获得nf1条件性敲除构建示意图；
24.图2是同源重组载体质粒图谱；
25.图3是同源重组载体酶切鉴定电泳图；
26.图4是构建的flox小鼠基因型鉴定；
27.图5是dna水平cre活性验证；
28.图6是f0代小鼠5’同源臂和3’同源臂pcr鉴定电泳图；
29.图7是f1代小鼠5’同源臂和3’同源臂pcr鉴定电泳图；
30.图8是11月龄基因敲除小鼠mri影像图像；
31.图9是11月龄基因敲除小鼠成瘤he染色结果；
32.图10是小鼠成瘤免疫组化染色示意图；
33.图11是11月龄基因敲除小鼠沿脊神经解剖图。
具体实施方式
34.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
35.本技术提供一种nf1基因敲除动物模型的构建方法。以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。
36.本技术实施例提供一种nf1基因敲除小鼠模型及其构建方法，如图1所示，针对nf1基因特定区域构建包含3.0kb 5’同源臂、2.9kb的flox区域和3.0kb 3’同源臂。对预定敲除区域两侧使用cas/grna方式进行loxp标记，得到flox小鼠，与cre小鼠杂交结合cre后得到nf1基因条件性敲除小鼠。
37.下面结合具体实施例进行说明。
38.实施例一、获得grna
39.本实施例的获得针对nf1基因的grna的方法如下：
40.(1)选取基因打靶所用细胞：c57bl/6遗传背景小鼠施万细胞；
41.(2)设计针对nf1基因的grna靶序列，用于制备grna的引物：primer01如seq id no.1或seq id no.2所示，primer02如seq id no.3所示。primer01和primer02于13000rpm
离心1min，完成后primer01管中加入75μlddh2o，primer02管中加入256μl ddh2o，直接于常温静置备用；
42.(3)按如下体系于pcr管中配制混合体系：
[0043][0044]
(max dna polymerase货号：r045a)
[0045]
(4)150μl体系分装六管，每管25μl。于pcr仪中进行pcr反应，程序如下：98℃，2min变性后，98℃10s，55℃15s，72℃5s，34个循环，最后72℃20s，结束。产物进行琼脂糖凝胶电泳，1％琼脂糖凝胶，200v跑10min。割胶，使用qiaquick gel extraction kit(cat：no.28706)回收；
[0046]
(5)t7transcription kit(thermo，货号：am1334)转录；
[0047]
(6)使用megaclear
tm
transcription clean-up kit(thermo，货号：am1908)纯化。保存于-80℃。
[0048]
实施例二、获得cas9 mrna
[0049]
本实施例通过体外转录的方式，获得cas9 mrna，具体方法如下：
[0050]
(1)质粒px-t7(cas9)10μg，xbai酶加5μl，总体系100μl；使用xbai线性化，37℃反应2h；
[0051]
(2)加10μl醋酸铵，混匀，加200μl无水乙醇，混匀，13000rpm离心5min，弃上清，13000rpm离心1min，吸干残液，加20μl无核酸酶的水；
[0052]
(3)使用mmessage mmachine t7 ultra kit(invitrogen，am1345)体外转录；
[0053]
(4)使用megaclear
tm
transcription clean-up kit(invitrogen，am1908)纯化，保存于-80℃。
[0054]
实施例三、同源重组载体的构建
[0055]
本实施例的同源重组载体的构建方法如下：
[0056]
(1)用如seq id no.8和seq id no.9所示的序列作为引物，以野生型小鼠基因组作为模板，pcr扩增获得所述5’同源臂的目的片段；用如seq id no.10和seq id no.11所示的序列作为引物，以野生型小鼠基因组作为模板，pcr扩增获得所述flox区域的目的片段；用如seq id no.12和seq id no.13所示的序列作为引物，以野生型小鼠基因组作为模板，pcr扩增获得所述3’同源臂的目的片段，pcr引物见表1：
[0057]
表1
[0058][0059]
(2)用bamhi，hindiii双酶切质粒pbr-322，获得线性化pbr-322骨架片段，通过in-fusion hd cloning kit酶将所得目的片段5’同源臂、flox区域、3’同源臂和线性化pbr-322骨架进行重组，构建得到的同源重组载体命名为nf1-ecko1；
[0060]
(3)测序正确的克隆接种400ml lb，使用nucleobond xtra midi plus ef kit抽提质粒，溶于nuclease-free water中，-30℃保存：nucleobond xtra midi plus ef kit大抽质粒过程如下：
[0061]
s1：实验前准备：将棕色瓶的rnase加入buffer res ef，做好标记4℃存放；
[0062]
s2：400ml的菌液分装8管装入50ml的离心管中，4℃下4800rpm离心10min，弃干净上清液；
[0063]
s3：每管加入4ml配置好的res ef溶液，用1ml移液枪吹打至无块状均匀体系，每4管溶液合并成一管，最后共两管，每管16ml；
[0064]
s4：每管加入16ml的buffer lys ef(蓝色)，及时的盖上盖子后缓慢颠倒摇晃约4至5次，静置，计时，从倒入lys ef溶液至加入溶液neu ef中间不得超过5分钟；
[0065]
s5：反应接近5分钟时，小心打开盖子，每管加入16ml的neu ef溶液，缓慢颠倒直至体系全部变成白色絮状，放置冰上15分钟，同时将试剂盒中的xtra midi filter放入xtra midi columns，放入架子，柱子中加入适量(加满)equ ef溶液，润湿中间的棉芯；
[0066]
s6：待equ滴净(棉芯未干)，将冰上的溶液取出，摇匀，倒入柱子，隔段时间上样一次，不可使棉芯变干；
[0067]
s7：待滴干后，向柱子加入5ml的fil ef溶液，加液时均匀的滴在棉芯向上露出的位置，不可直接加入棉芯中间，滴干后弃棉芯；
[0068]
s8：柱子中加入35ml的endo ef溶液，滴干后加入15ml的wash ef溶液；
[0069]
s9：滴干后，每管中加入5ml的elu ef洗脱，滴干后用枪吹打溶液，吹打时不可使溶液滴在壁上，反复吹打10次左右，每管平均分装成6管，约830ul/ep管；
[0070]
s10：每个ep管中加入0.7倍体积的异丙醇，约583ul/管，摇匀后12800rpm 4℃离心15分钟；
[0071]
s11：离心后会看到ep管底部有白色花瓣状物质即为质粒，小心(质粒略滑)弃净上清后，每管加入1ml的75％乙醇洗涤，常温13000rpm离心5min；
[0072]
s12：离心后弃净上清，盖好盖子后短离心20秒，平稳小心的取出，不可颠倒剧烈碰撞，打开盖子后用枪尽量吸去管底的残液，注意不可将质粒吸入枪头；
[0073]
s13：室温晾2min，每管加入20ul的无核酸酶的水，放入56℃烘箱溶解10分钟后取出，利用滤芯枪头合并为一管，吸取2ul定量，大抽质粒完成。
[0074]
如图2所示为构建的同源重组载体质粒的图谱，对构建的同源重组载体进行酶切鉴定，反应体系如下：15.9μl ddh20,2μl 10
×
buffer,1.5μl sphl,0.6μl plasmid dna.混匀体系，放入37℃水浴锅，反应2小时后，加入适量的gel loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，待条带分离后进行拍照。构建成功的理论条带大小为7977bp、4509bp，鉴定结果如图3所示，可见电泳结果显示酶切后具有7977bp、4509bp两条条带，说明同源重组质粒酶切结果符合预期，可送测序验证。
[0075]
实施例四、nf1基因敲除小鼠模型构建
[0076]
本实施例的nf1基因敲除小鼠模型构建如下：
[0077]
(1)将cas9 mrna、grna和同源重组载体显微注射到小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠；
[0078]
(2)将阳性f0代小鼠与野生型小鼠交配，获得f1代小鼠，即为nf1基因敲除小鼠模型；
[0079]
(3)将f1代小鼠与具有施万细胞特异性cre表达的小鼠交配，获得施万细胞条件性敲除nf1基因小鼠模型。
[0080]
如图4所示为构建的flox小鼠基因型鉴定。flox小鼠是把两个loxp位点放到目的基因一个或几个重要的外显子两端而得到，该目的基因表达不受loxp插入的影响，本实验鉴定flox小鼠基因型，是利用loxp位点插入后，野生型和突变型pcr鉴定时，pcr产物片段的大小不同来区分不同的基因型。如图4所示突变型有252bp条带，野生型条带大小为196bp，说明flox小鼠构建成功。
[0081]
从nf1基因敲除小鼠中取一小块表达cre的组织，抽提基因组dna，通过pcr的方法对flox区域进行扩增，通过flox区域的有无，定性判断cre是否发挥作用。设计前引物(如seq id no.14所示)和后引物(如seq id no.15所示)，pcr结果见图5，结果显示包含cre活性965bp；无cre活性2993bp；野生型2880bp。
[0082]
对f0代小鼠同源臂进行pcr鉴定。5’同源臂的pcr引物序列如seq id no.4和seq id no.5所示，3’同源臂的pcr引物序列如seq id no.6和seq id no.7所示。
[0083]5’
同源臂pcr鉴定
[0084]
pcr引物序列:forward-ttagtttgtgggtcattgtttcag
[0085]
reverse-gacctcggctccacttctttta
[0086]3’
同源臂pcr鉴定
[0087]
pcr引物序列:forward-atcctcttgccaattccacacga
[0088]
reverse-tatctcttgcctccacttgctacg
[0089]5’
臂同源重组阳性基因组应扩增出5.3kb片段，阴性基因组应扩增出9.6kb片段；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出5.6kb片段，阴性基因组应扩增出9.0kb片段，如图6所示，数字代表f0代小鼠编号，wt代表野生型对照，表明f0代同源重组小鼠构建成功。
[0090]
对f1代小鼠同源臂进行pcr鉴定。其pcr方法同f0代小鼠pcr鉴定，结果如图7所示，
marker左侧为f1代小鼠5’同源臂pcr鉴定结果，marker右侧为f1代小鼠3’同源臂pcr鉴定结果，数字为f1代小鼠编号，wt为野生型对照，m为1kb dna ladder，结果表明1、2、3、4、5、7、8号小鼠5’同源臂扩增出5.3kb片段，3’同源臂扩增出5.6kb片段，同源重组阳性，说明f1代同源重组小鼠构建成功。
[0091]
实施例五、验证ⅰ型神经纤维瘤nf1基因施万细胞条件敲除小鼠动物模型能够成瘤
[0092]
本实施例提供的ⅰ型神经纤维瘤nf1基因施万细胞条件敲除小鼠动物模型能够成瘤的验证方法如下：
[0093]
对11月龄基因敲除小鼠处死后根据影像学观察结果，沿着脊柱进行解剖，沿小鼠背部分离切开皮肤、皮下组织，逐步游离脊髓，结果如图11所示，可见脊神经颈部臂丛发出部位有小结节样结构，取出进行包埋封片，送病理检查。
[0094]
对11月龄基因敲除小鼠和对照组进行水合氯醛腹腔麻醉，待完全麻醉后进行mri影像学观察，结果如图8所示，可见t2下明显脊柱周围高亮圆形信号影，对比对照组影像学图像，初步认为脊柱旁神经纤维瘤成瘤。
[0095]
对包埋切片进行he染色观察，如图9所示，图9a为1x，图9b为10x，显示脊柱多个周围结节为丛状神经纤维瘤样组织，符合丛状神经纤维瘤特征。
[0096]
对包埋切片进行免疫组化染色观察，图10a为sox-10免疫组化染色，图10b为ki-67免疫组化染色，图10c为s-100β免疫组化染色，图10d为pcna免疫组化染色，显示脊柱多个周围结节为丛状神经纤维瘤样组织，符合丛状神经纤维瘤特征。
[0097]
根据本技术提供的制备方法获得的施万细胞nf1基因条件性敲除小鼠可成功长出丛状神经纤维瘤，是国内目前首个i型神经纤维瘤可稳定成瘤的转基因小鼠模型，为i型神经纤维瘤发生发展机制的探索和相关治疗方案的研究提供了稳定可行的平台基础。
[0098]
以上对本技术所提供的一种nf1基因敲除动物模型的构建方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本技术的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本技术的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本技术的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本技术的限制。